作者：黎妍妍 冯吉 王林 付裕 李锡宏
来源：《中国烟草科学》2021年第01期
摘 要：基于大田試验和Illumina Hiseq扩增子测序技术，分析了万寿菊-烟草轮作对植烟土壤细菌落多样性和结构的影响，旨在为缓解烟草连作障碍提供理论依据。结果表明，万寿菊-烟草轮作可提高烟株根际土壤细菌落Sobs、Shannon和Chao 1等多样性和丰富度指数;提升土壤中酸杆菌门（Acidobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度;促使生防菌（Pseudomonas）、功能菌（Candidatus_Solibacter、Bryobacter和Bradyrhizobium）、降解菌（Massilia、Novosphingobium和Ramlibacter）和根际促生菌（Flavisolibacter）等菌属比例上升，有利于改善土壤微生态环境、缓解连作障碍。
关键词：万寿菊;轮作;细菌落;多样性
Abstract： The research aims to provide a theoretical basis for alleviating the obstacles of tobacco continuous cropping. Field experiments and amplicon sequencing based on Illumina Hiseq were conducted to explore the effects of marigold-tobacco rotation on the diversity and structure of bacterial communities in tobacco rhizosphere soil. The results showed that marigold-tobacco rotation could greatly improve the Sobs， Shannon， Chao 1 indexes of soil bacterial communities. And， marigold-tobacco rotatio
n can also improve the relative abundance of Acidobacteria and Bacteroidetes， and increase the proportion of biocontrol bacterium genera （Pseudomonas）， functional bacteria genera （Candidatus_Solibacter， Bryobacter and Bradyrhizobium）， degrading bacteria genera （Massilia， Novosphingobium and Ramlibacter） and plant growth promoting rhizobacteria （Flavisolibacter）. In conclusion， marigold-tobacco rotation is strongly conducive to the improvement of soil microecological environment and alleviation of the obstacles of tobacco continuous cropping.
Keywords： marigold; rotation; bacterial community; diversity
烟草是我国重要的经济作物，属茄科忌连作的作物。然而，目前连作是我国烟草的主要种植制度，烟草连作面积占总种植面积的30%～60%[1]。长期连作可导致土壤养分失衡[2]和肥料利用率下降[3];化感物质（或潜在化感物质）增多[4];根际微生态失调，土壤中与营养元素循环相关的微生物数量降低，而病原微生物数量增加[5-6];由此形成连作障碍，即使在正常管理情况下也会出现烟草生育状况变差、产量和品质降低、病虫害发生加重等问题。
万寿菊（Tagetes erecta L.）为菊科万寿菊属植物，多用于素提取。近年来的研究表明，万寿菊与烟草、大豆等作物轮作可有效降低土壤中线虫的数量，提升线虫多样性指数，有利于线虫落结构的平衡[7-8];万寿菊-当归轮作对土壤真菌落组成具有显著影响[9];万寿菊-烟草套作可提高根际土壤细菌落多样性[10]。因此，万寿菊的不同利用方式在调控土壤微生态方面具有明显的积极作用。然而，能否通过万寿菊-烟草轮作来调理植烟土壤细菌落结构，缓解烟草连作障碍，却鲜有报道。本研究通过在连作数年的烟田进行万寿菊-烟草轮作，分析评价土壤细菌落结构的变化，以期为寻求缓解或克服烟草连作障碍的方法提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 田间试验设置
试验于2016—2018年在湖北省恩施州宣恩县椒园镇凉风村进行。试验地烟草连作15年，种植烟草品种为云烟87。试验包括2个处理，3次重复，共6个小区。处理1：烟草连作（C）;处理2：万寿菊-烟草轮作（R），即2016—2017年种植万寿菊、2018年种植烟草。烟草行株距为1.2 m×0.55 m，每小区种植烤烟100株，4月25日移栽。
1.2 土壤样品采集
2018年，处理1和处理2中烟草移栽后50 d、100 d时，采用5点取样法采集烟株根际土壤样品（与根系结合较紧密的土壤，在4 mm内），分别记作C_50、R_50、C_100和R_100。每个处理3个重复，共计12个土样。采集后的土样置于干冰中带回实验室，保存于–80 ℃冰箱，用于DNA提取。
1.3 土壤细菌落分析
1.3.1 DNA提取及PCR扩增 采用FastDNA Spin Kit试剂盒（MP Biomedicals， USA）提取土样总DNA。以样品DNA为模板，采用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对细菌16S rDNA V4可变区进行PCR扩增。扩增体系（30 µL）包括：15 µL Phusion Master Mix Buffer（2×）、3 µL引物（2 μmol/L）、10 µL DNA（1 ng/μL）模板和2 µL ddH2O。反应程序：98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（30个循环）;72 ℃ 5 min（Bio-rad T100梯度PCR仪）。PCR产物经检测合格后进行文库构建，在Illumina Hiseq PE250测序平台进行测序（诺禾致源生物信息科技有限公司）。
firmicutes 1.3.2 OTU聚类与物种注释 以97%的一致性将所有样品的有效序列聚类成为OTU（Operational Taxonomic Units）。对OTU代表序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种的注释分析。
1.4 数据处理
利用R软件（V 2.15.3）绘制稀释曲线图。利用Qiime软件（V 1.9.1）计算Sobs、Chao1丰富度指数和Shannon多样性指数。用SPSS 22.0中的Student's t-test分析细菌落丰富度和多样性指数、物种相对丰度等在烟草连作田和轮作田土壤间的差异（p<0.05水平）。在属水平上，采用LEfSe（LDA Effect Size）多级物种差异判别分析（LDA值=3）检测连作田和轮作田土壤中具有显著丰度差异的菌属。
2 结 果
2.1 数据质控
对烟草连作田和轮作田土壤细菌落进行了数据质控与分析。结果表明（表1），4组样品的有效序列数均在80 000条以上，平均序列长度在253～254 bp之间。在97%一致性
的OTU分类水平下，获得C_50、R_50、C_100和R_100的细菌OTU数量均在5000个以上，其中烟草移栽后50 d和100 d轮作田（R）土壤细菌落OTU数量分别较烟草连作田（C）高1.26%和5.67%。
2.2 土壤细菌落多样性和丰富度分析
烟草连作田和轮作田土壤细菌落多样性和丰富度指数见表2。结果表明，烟草移栽后50 d，轮作田（R_50）土壤细菌落Sobs、Shannon和Chao 1指数分别较连作田（C_50）增加0.12%、0.41%和2.41%;烟草移栽后100 d，轮作田（R_100）土壤细菌落Sobs、Shannon和Chao 1指数分别较连作田（C_100）增加5.41%、4.00%和13.02%，其中shannon（p=0.025）和Chao 1指数（p=0.049）在R_100和C_100间存在显著差异。以上结果表明，万寿菊-烟草轮作可提高土壤细菌落的多样性和丰富度。
2.3 土壤细菌门水平的组成及差异分析
对相对丰度高于1%的土壤细菌门进行了分析（表3）。结果表明，烟草连作田和轮作田烟草移栽后50 d时根际土壤高于1%的细菌门的相对丰度分别共占96.39%和95.20%;煙草
移栽后100 d时分别共占96.82%和95.32%。变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和浮霉菌门（Planctomycetes）的相对丰度在C_50、R_50、C_100和R_100中均高于1%;此外，奇古菌门（Thaumarchaeota）在C_50和C_100中的相对丰度也高于1%。Student’s t-test差异分析结果表明，烟草移栽后50 d时，轮作田（R_50）土壤中酸杆菌门和拟杆菌门的相对丰度显著高于连作田（C_50）;烟草移栽后100 d时，轮作田（R_100）土壤中奇古菌门的相对丰度显著低于连作田（C_100）。
2.4 土壤细菌属水平的组成及差异分析
2.4.1 土壤细菌属水平的组成 对相对丰度高于1%的土壤细菌属进行了分析（图1）。结果表明，烟草移栽后50 d时，烟草连作田（C_50）和轮作田（R_50）土壤中鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、Pseudarthrobacter、乳杆菌属（Lactobacillus）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、H16、RB41和Bryobacter的相对丰度均高于1%;此外，unidentified_
Gemmatimonadaceae和水恒杆菌属（Mizugakiibacter）的相对丰度在C_50中高于1%，但在R_50中低于1%;马赛菌属（Massilia）的相对丰度在R_50中高于1%，但在C_50中低于1%。烟草移栽后100 d时，烟草连作田（C_100）和轮作田（R_100）土壤中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、Pseudarthrobacter、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、H16、马赛菌属（Massilia）和Ramlibacter的相对丰度均高于1%;此外，慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）的相对丰度在R_100中高于1%，但在C_100中低于1%。
2.4.2 细菌属水平上的LEfSe多级物种差异判别分析 在细菌属水平上，对烟草连作田和轮作田土壤细菌落进行了LEfSe物种差异判别分析（图2）。结果表明，烟草移栽后50 d时，烟草连作田（C_50）和轮作田（R_50）根际土壤共有8个细菌属存在显著性差异，其中C_50中水恒杆菌属（Mizugakiibacter）、魏斯氏菌属（Weissella）、unidentified_Gemmatimonadaceae和链球菌属（Streptococcus）;R_50中假单胞菌（Pseudomonas）、Candidatus_Solibacter、马赛菌属（Massilia）和RB41是烟草连作田和轮作田土壤细菌落差异的主要类。烟草移栽后100 d时，烟草连作田（C_100）和轮作田（R_100）根际土壤共有9个细菌属存在显著性差异，其中C_100中Rhodanobacter和Gaiella;R_100中慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium）、
Bryobacter、水库杆菌属（Piscinibacter）、黄土源菌（Flavisolibacter）、Ramlibacter和马赛菌属（Massilia）是烟草连作田和轮作田土壤细菌落差异的主要类。
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