①在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ②引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
退火温度Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)
③Tm对于设定pcr退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
④引物退火温度
退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降;温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算：
Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃
其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果(G+C)%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时(如0.2μmol/L),退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。
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