一种级联酶催化交联天然多糖水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用多功能水凝胶材料技术领域，具体涉及一种级联酶催化交联天然多糖水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

2.伤口愈合是生物组织在受伤后自我修复的固有能力。然而，在由细菌如大肠杆菌和金黄葡萄球菌引起的感染情况下，可能会发生严重的并发症。伤口感染引发机体免疫反应，引发炎症，减缓愈合过程，甚至需要医疗干预，导致医疗费用增加。如果不及时，感染可能会恶化，甚至导致败血症。因此，为了加速整个伤口愈合的过程，伤口敷料的使用是不可或缺的。在诸多类型的伤口敷料中，水凝胶敷料具有独特的优势，其多孔结构有利于营养物质的传输，还可吸收伤口部位的渗出液，保持伤口的湿润以及形状可适性等。水凝胶作为一种良好的载体，可以负载抗菌药物或过渡金属氧化物等，用以实现特定的功能促进伤口愈合，但是该方法会产生耐药性等副作用。传统的自由基聚合和交联制备水凝胶，使用具有一定毒性的引发剂和较为严苛的制备条件，而不利于后续生物医用，因此采用温和的方法制备具有内在抗菌抗氧化粘附性的水凝胶伤口敷料在临床应用方面具有重要的意义。

技术实现要素：

3.本发明的目的在于针对现有负载抗菌药物等水凝胶材料存在的不足，提供了一种级联酶催化交联天然多糖水凝胶及其制备方法，该方法首先将苯酚基团和5-甲基糠基接枝到天然多糖上，再将其与末端含有马来酰亚胺基团的季铵盐交联剂qmal相复合，以尿酸作为底物，在尿酸氧化酶和辣根过氧化物酶级联催化作用下，首先实现酚交联即第一重交联，同时季铵盐交联剂qmal中的马来酰亚胺基团与天然多糖上接枝的5-甲基糠基通过diels-alder反应实现第二重交联，从而得到了双交联多功能天然多糖水凝胶，其中季铵盐基团增强了天然多糖水凝胶的抗菌性，酚基团赋予天然多糖水凝胶优异的抗氧化性；另外尿酸氧化酶催化尿酸氧化产生的副产物尿囊素还具有消炎和加速伤口愈合的作用，因此制得的级联酶催化交联天然多糖水凝胶能够作为有潜力的医用伤口敷料。
4.本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种级联酶催化交联天然多糖水凝胶的制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤s1：将含有氨基的天然多糖或含有羧基的天然多糖溶于去离子水中得到含有氨基的天然多糖溶液或含有羧基的天然多糖溶液，其中含有氨基的天然多糖为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖或羟乙基壳聚糖，含有羧基的天然多糖为透明质酸钠、海藻酸钠或硫酸软骨素；步骤s2：向步骤s1得到的含有氨基的天然多糖溶液中加入对羟基苯甲醛，于室温搅拌反应，再向反应液中加入硼氢化钠继续反应，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到苯酚基团接枝的氨基多糖；或者向步骤s1中得到的含有羧基的天然多糖溶液中加入酪胺或酪氨酸，在催化剂的作用下发生酰胺化反应将苯酚基团接枝到羧基
多糖上，其中催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到苯酚基团接枝的羧基多糖；步骤s3：将步骤s2得到的苯酚基团接枝的氨基多糖溶于去离子水中，加入5-甲基糠醛并于室温搅拌反应，再向反应液中加入硼氢化钠继续反应，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖；或者将步骤s2得到的苯酚基团接枝的羧基多糖溶于去离子水中，加入5-甲基糠胺，在催化剂的作用下发生酰胺化反应将5-甲基糠基接枝到羧基多糖上，其中催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖；步骤s4：将4-溴甲基苯甲醛和n,n,n’,n
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四甲基-1,3-丙二胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，于30~80℃搅拌反应，反应完成后将反应液用乙醚或四氢呋喃沉淀，得到含季铵盐中间产物；步骤s5：将步骤s4得到的含季铵盐中间产物溶于去离子水中，再加入1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐进行反应得到季铵盐交联剂qmal溶液，该季铵盐交联剂qmal的结构式为；步骤s6：以尿酸水溶液作为溶剂，将步骤s3得到的接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶解得到接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖溶液或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶液，再将其与步骤s5得到的季铵盐交联剂qmal溶液混合均匀，然后依次加入尿酸氧化酶溶液和辣根过氧化物酶溶液，混合均匀得到成胶前驱液并将该成胶前驱液于室温静置得到级联酶催化交联天然多糖水凝胶。
5.进一步限定，步骤s1中所述含有氨基的天然多糖溶液或含有羧基的天然多糖溶液的浓度均为20~100mg/ml。
6.进一步限定，步骤s2中所述对羟基苯甲醛与含有氨基的天然多糖中氨基基团的摩尔比为0.2~2.0:1，硼氢化钠与对羟基苯甲醛的摩尔比为0.2~1.0:1；步骤s2中所述酪胺或酪氨酸与含有羧基的天然多糖中羧基基团的摩尔比为0.2~2.0:1，催化剂与含有羧基的天然多糖中羧基基团的摩尔比为0.2~5:1。
7.进一步限定，步骤s3中所述5-甲基糠醛与苯酚基团接枝的氨基多糖中氨基基团的摩尔比为0.2~2.0:1，硼氢化钠与5-甲基糠醛的摩尔比为0.2~1.0:1；步骤s3中所述5-甲基糠胺与苯酚基团接枝的羧基多糖中羧基基团的摩尔比为0.2~2.0:1，催化剂与苯酚基团接
枝的羧基多糖中羧基基团的摩尔比为0.2~5:1。
8.进一步限定，步骤s4中所述4-溴甲基苯甲醛与n,n,n’,n
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四甲基-1,3-丙二胺摩尔比为2.0~4.0:1。
9.进一步限定，步骤s5中所述季铵盐交联剂qmal溶液的浓度为5~150mg/ml。
10.进一步限定，步骤s6中所述尿酸水溶液的浓度为1mg/ml，所述成胶前驱液于25~40℃静置2~720min得到级联酶催化交联天然多糖水凝胶。
11.进一步限定，步骤s6中所述接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖溶液或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶液的浓度均为30~100mg/ml，尿酸氧化酶溶液与接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖溶液或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶液的体积比为0.1~0.5:1，该尿酸氧化酶溶液的浓度为1~10mg/ml，辣根过氧化物酶溶液与接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖溶液或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶液的体积比为0.02~0.06:1，该辣根过氧化物酶溶液的浓度为2~20mg/ml。
12.本发明所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶，其特征在于是基于上述方法制得的。
13.本发明所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶在制备生物医用材料中的应用。
14.本发明与现有技术相比具有以下优点和有益效果：本发明提供的级联酶催化交联天然多糖水凝胶材料采用温和的酶催化交联策略，避免了传统自由基聚合和交联严苛的反应条件；同时含有抗菌性的季铵盐基团和抗氧化性的酚基团，避免了传统水凝胶材料通过负载抗菌、抗炎药物所带来的耐药性等缺点，具有长效促进创面愈合的作用，并且使用的凝胶组分为天然多糖高分子，具有良好的生物相容性和可降解性。
附图说明
15.图1是实施例1制备的级联酶催化交联天然多糖水凝胶冻干后的扫描电镜图；图2是实施例1制备的级联酶催化交联天然多糖水凝胶的抗菌性能测试结果；图3是实施例1制备的级联酶催化交联天然多糖水凝胶的抗氧化性测试结果；图4是实施例1制备的级联酶催化交联天然多糖水凝胶在小鼠皮肤全层伤口实验第14天时伤口组织的he染图。
具体实施方式
16.以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
17.实施例1步骤s1：将1g羧甲基壳聚糖溶于100ml去离子水中得到羧甲基壳聚糖溶液；步骤s2：向步骤s1得到的羧甲基壳聚糖溶液中加入0.6g对羟基苯甲醛，于室温搅拌反应4h，再向反应液中加入0.1g硼氢化钠继续反应12h，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析三天后冻干得到含有苯酚基团的羧甲基壳聚糖；步骤s3：将0.5g步骤s2得到的接枝苯酚基团的羧甲基壳聚糖溶于50ml去离子水中，加入0.14g 5-甲基糠醛，于室温搅拌反应1h，再向反应液中加入0.05g硼氢化钠继续反
应12h，反应完成后将反应液装入透析袋，放入去离子水中透析三天后冻干得到接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧甲基壳聚糖；步骤s4：将0.2g 4-溴甲基苯甲醛和0.4g n,n,n’,n
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四甲基-1,3-丙二胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，于60℃搅拌反应12h，反应完成后将反应液用乙醚沉淀，得到含季铵盐中间产物；步骤s5：将60mg步骤s4得到的含季铵盐中间产物溶于1ml去离子水中，再加入40mg 1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐进行反应1h得到季铵盐交联剂qmal溶液；步骤s6：使用1mg/ml的尿酸水溶液作为溶剂，将50mg步骤s3得到的接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧甲基壳聚糖溶解到1ml尿酸水溶液中，然后将其与步骤s5得到的季铵盐交联剂qmal溶液按照 5-甲基糠基团和马来酰亚胺基团等当量混匀，然后加入150μl尿酸氧化酶水溶液（1mg/ml）和50μl辣根过氧化物酶水溶液（2mg/ml）并混合均匀后所得成胶前驱液于37℃静置300min得到级联酶催化交联天然多糖水凝胶。
18.实施例2步骤s1：将1g透明质酸钠溶于50ml去离子水中得到透明质酸钠溶液；步骤s2：向步骤s1得到的透明质酸钠溶液中加入0.5g酪胺和1.0g 4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，于室温搅拌反应12h，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析三天后冻干得到接枝苯酚基团的透明质酸钠；步骤s3：将0.5g步骤s2得到的接枝苯酚基团的透明质酸钠溶于50ml去离子水中，再加入0.15g 5-甲基糠胺和0.5g 4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，于室温搅拌反应12h，反应完成后将反应液装入透析袋，放入去离子水中透析三天后冻干得到接枝苯酚基团和5-甲基糠基的透明质酸钠；步骤s4：将0.4g 4-溴甲基苯甲醛和0.4g n,n,n’,n
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四甲基-1,3-丙二胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，于40℃搅拌反应24h，反应完成后将反应液用乙醚沉淀得到含季铵盐中间产物；步骤s5：将60mg步骤s4得到的含季铵盐中间产物溶于1ml去离子水中，再加入40mg 1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐进行反应1h得到季铵盐交联剂qmal溶液；步骤s6：使用1mg/ml的尿酸水溶液作为溶剂，将步骤s3得到的接枝苯酚基团和5-甲基糠基的透明质酸钠60mg溶解到1ml尿酸水溶液中，然后将其与步骤s5得到的季铵盐交联剂qmal溶液按照 5-甲基糠基团和马来酰亚胺基团等当量混匀，然后加入160μl尿酸氧化酶水溶液（1mg/ml）和40μl辣根过氧化物酶水溶液（2mg/ml）并混合均匀后所得成胶前驱液于37℃静置600min得到级联酶催化交联天然多糖水凝胶。
19.为了说明本发明提供的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶的各项性能，对实施例1制备的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶进行了测试，测试结果见图1～4。
20.图1为实施例1制备的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶冻干后的扫描电镜图，由图可以观察到三维贯穿网状骨架结构。
21.图2为实施例1制备的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶抗菌性能测试结果，如图所示，相对于空白对照组，制备的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶敷料对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄葡萄球菌展现出优异的抗菌性能。
22.图3为实施例1制备的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶抗氧化性测试结果，如图所
示，制备的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶敷料对羟基自由基展现出良好的清除能力。
23.图4为实施例1制备的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶在小鼠皮肤全层伤口实验第14天时伤口组织的he染图，相对于空白对照组，制备的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶敷料组具有较多的毛孔、血管等较为完整的皮肤组织和附属器官，新生表皮接近正常皮肤表皮的厚度，证明了所制备多功能水凝胶敷料具有良好的促进伤口愈合的性能。
24.综上所述，本发明制备的级联酶催化交联壳聚糖水凝胶展现出良好的抗菌、抗氧化等性能，并在小鼠皮肤全层伤口实验中，能够促进较为成熟皮肤组织及其附属器官的再生，从而加速伤口的愈合。
25.以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

技术特征：

1.一种级联酶催化交联天然多糖水凝胶的制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤s1：将含有氨基的天然多糖或含有羧基的天然多糖溶于去离子水中得到含有氨基的天然多糖溶液或含有羧基的天然多糖溶液，其中含有氨基的天然多糖为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖或羟乙基壳聚糖，含有羧基的天然多糖为透明质酸钠、海藻酸钠或硫酸软骨素；步骤s2：向步骤s1得到的含有氨基的天然多糖溶液中加入对羟基苯甲醛，于室温搅拌反应，再向反应液中加入硼氢化钠继续反应，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到苯酚基团接枝的氨基多糖；或者向步骤s1中得到的含有羧基的天然多糖溶液中加入酪胺或酪氨酸，在催化剂的作用下发生酰胺化反应将苯酚基团接枝到羧基多糖上，其中催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到苯酚基团接枝的羧基多糖；步骤s3：将步骤s2得到的苯酚基团接枝的氨基多糖溶于去离子水中，加入5-甲基糠醛并于室温搅拌反应，再向反应液中加入硼氢化钠继续反应，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖；或者将步骤s2得到的苯酚基团接枝的羧基多糖溶于去离子水中，加入5-甲基糠胺，在催化剂的作用下发生酰胺化反应将5-甲基糠基接枝到羧基多糖上，其中催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖；步骤s4：将4-溴甲基苯甲醛和n,n,n’,n
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四甲基-1,3-丙二胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，于30~80℃搅拌反应，反应完成后将反应液用乙醚或四氢呋喃沉淀，得到含季铵盐中间产物；步骤s5：将步骤s4得到的含季铵盐中间产物溶于去离子水中，再加入1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐进行反应得到季铵盐交联剂qmal溶液，该季铵盐交联剂qmal的结构式为；步骤s6：以尿酸水溶液作为溶剂，将步骤s3得到的接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶解得到接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖溶液或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶液，再将其与步骤s5得到的季铵盐交联剂qmal溶液混合均匀，然后依次加入尿酸氧化酶溶液和辣根过氧化物酶溶液，混合均匀得到成胶前驱液并将该成胶前驱液于室温静置得到级联酶催化交联天然多糖水凝胶。2.根据权利要求1所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步
骤s1中所述含有氨基的天然多糖溶液或含有羧基的天然多糖溶液的浓度均为20~100mg/ml。3.根据权利要求1所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤s2中所述对羟基苯甲醛与含有氨基的天然多糖中氨基基团的摩尔比为0.2~2.0:1，硼氢化钠与对羟基苯甲醛的摩尔比为0.2~1.0:1；步骤s2中所述酪胺或酪氨酸与含有羧基的天然多糖中羧基基团的摩尔比为0.2~2.0:1，催化剂与含有羧基的天然多糖中羧基基团的摩尔比为0.2~5:1。4.根据权利要求1所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤s3中所述5-甲基糠醛与苯酚基团接枝的氨基多糖中氨基基团的摩尔比为0.2~2.0:1，硼氢化钠与5-甲基糠醛的摩尔比为0.2~1.0:1；步骤s3中所述5-甲基糠胺与苯酚基团接枝的羧基多糖中羧基基团的摩尔比为0.2~2.0:1，催化剂与苯酚基团接枝的羧基多糖中羧基基团的摩尔比为0.2~5:1。5.根据权利要求1所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤s4中所述4-溴甲基苯甲醛与n,n,n’,n
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四甲基-1,3-丙二胺摩尔比为2.0~4.0:1。6.根据权利要求1所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤s5中所述季铵盐交联剂qmal溶液的浓度为5~150mg/ml。7.根据权利要求1所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤s6中所述尿酸水溶液的浓度为1mg/ml，所述成胶前驱液于25~40℃静置2~720min得到级联酶催化交联天然多糖水凝胶。8.根据权利要求1所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤s6中所述接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖溶液或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶液的浓度均为30~100mg/ml，尿酸氧化酶溶液与接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖溶液或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶液的体积比为0.1~0.5:1，该尿酸氧化酶溶液的浓度为1~10mg/ml，辣根过氧化物酶溶液与接枝苯酚基团和5-甲基糠基的氨基多糖溶液或接枝苯酚基团和5-甲基糠基的羧基多糖溶液的体积比为0.02~0.06:1，该辣根过氧化物酶溶液的浓度为2~20mg/ml。9.一种级联酶催化交联天然多糖水凝胶，其特征在于：所述级联酶催化交联天然多糖水凝胶是基于权利要求1~8中任意一项所述的方法制得的。10.权利要求9所述的级联酶催化交联天然多糖水凝胶在制备生物医用材料中的应用。

技术总结

本发明公开了一种级联酶催化交联天然多糖水凝胶及其制备方法和应用，将苯酚基团和5-甲基糠基接枝到天然多糖上，再将其与末端含有马来酰亚胺基团的季铵盐交联剂QMal相复合，以尿酸作为底物，在尿酸氧化酶和辣根过氧化物酶级联催化作用下，首先实现酚交联即第一重交联，同时季铵盐交联剂QMal中的马来酰亚胺基团与天然多糖上接枝的5-甲基糠基通过Diels-Alder反应实现第二重交联，最终得到双交联多功能天然多糖水凝胶。该天然多糖水凝胶中季铵盐基团增强了天然多糖水凝胶的抗菌性，酚基团赋予天然多糖水凝胶优异的抗氧化性，尿酸氧化酶催化尿酸氧化产生的副产物尿囊素还具有消炎和加速伤口愈合的作用。炎和加速伤口愈合的作用。炎和加速伤口愈合的作用。