任清短杆菌新菌种及其应用

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种任清短杆菌新菌种及其应用。

背景技术：

2.白酒是世界三大蒸馏酒之一，“以麦制曲、用曲发酵”的传统酿造工艺造就了白酒独有的品质特征。酒曲是将小麦、大麦或掺入一定比例的豌豆经轧碎后加水拌匀踏成曲坯，经自然培养而成的含多种微生物和酶系的复合糖化发酵剂。酿造过程中,酒曲微生物不仅发挥了糖化发酵作用，而且具有重要的生香增味作用，酒曲微生物的种类和丰度对白酒的出酒率和风味有极大的影响。
3.清香型白酒风味品质与酒曲品质密切相关，酒曲微生物的种类和丰度是酒曲的重要特征，清香型白酒是北方白酒的主流，其工艺特点是将高粱等谷物蒸熟，拌曲后地缸发酵，没有窖泥，其风味物质主要由谷物原料经过酒曲微生物和酒醅中酶系发酵转化生成，酒曲微生物的种类和丰度对酿造清香型白酒至关重要。
4.酒曲微生物主要来源于制曲原料和制曲环境。自然界中的微生物多种多样，具有非常丰富的物种多样性，但是大多数微生物还处于难培养状态。微生物在不同环境中的可培养性虽有不同，但都很低，如海水中为0.1％以下，在土壤中约为0.3％。使用传统的细菌培养方法仅能培养自然生境中的一小部分细菌。目前，通常采用常规的培养基进行分离筛选，比如，预从酒曲中分离筛选短杆菌类细菌，现有的技术通常采用lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l)分离筛选，这样会导致常见的细菌迅速繁殖生长，抑制一些难培养新的微生物的繁殖生长，以至很难分离筛选出新的微生物。因此，目前从酒曲中尚未分离筛选出新的短杆菌。因此，如何从麦曲中分离鉴定分离微生物并对其进行功效研究，对于清香型白酒生产和品质调控具有重要的意义。

技术实现要素：

5.为此，本发明提供任清短杆菌新菌种及其应用。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供新菌株，所述菌株为任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.19203。
8.本发明还提供一种菌剂，其活性成分为上述所述的菌株。
9.上述所述的菌株或所述的菌剂在如下(a1)或(a2)中的应用：
10.(a1)产生风味物质；
11.(a2)制备具有风味物质的产品。
12.上述所述的菌株或所述的菌剂在如下(b1)或(b2)中的应用：
13.(b1)酿酒；
14.(b2)制备酿酒产品。
15.本发明还提供上述所述的菌种在制备所述菌剂中的应用。
16.本发明还提供菌株，所述菌株为任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)中菌株，所述任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)中菌株的16s rdna序列与seq id no.1相比相似性低于98.7％。
17.优选地，将酒曲稀释后涂布于乳酸菌琼脂培养基上，37℃好氧培养48h，三区划线纯化培养3次，得到纯培养细菌，将所述纯培养细菌pcr技术扩增16srdna，对序列对比分析，得到所述任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)。
18.优选地，所述乳酸菌培养基包括以下质量份数的原料：胰酪蛋白胨8-12份、酵母浸粉4-8份、磷酸二氢钾4-8份、柠檬酸胺1-4份、乙酸钠20-30份、硫酸镁0.2-0.8份、硫酸锰0.05-0.2份、亚硫酸铁0.01-0.04份、吐温80 0.5-2份、葡萄糖15-25份、琼脂10-20份，蒸馏水定容至1000份。
19.本发明具有如下优点：
20.试验证明，本发明提供一株新菌种任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)，该菌株分离字酿酒窖泥，其能够产生清香风味物质，可用于发酵酿酒。
21.本发明分离菌种，先采用乳酸杆菌选择性琼脂配方，常见的细菌繁殖较慢，同一培养皿上，难培养新的芽孢杆菌属细菌生长较快，受常规微生物影响小；同时，延长培养时间48h后挑取单菌落，难培养新的微生物经过长时间充分的生长，直至可见的菌落。
22.菌种保藏说明：本发明的任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)，于2019年12月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为cgmcc no.19203。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
24.图1为本发明提供的任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)透射电镜照片图；
25.图2为本发明提供的任清短杆菌的甲基萘醌mk-8(h2)的检测结果图；
26.图3为本发明提供的任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)16s rdna序列及进化树图。
27.图4为本发明提供的任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)极性酯检测结果图。
具体实施方式
28.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1、任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)的分离与鉴定
30.一、任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)新菌种的分离
31.步骤一、配置乳酸杆菌选择性琼脂配方：胰酪蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、磷酸二氢钾6.0g、柠檬酸胺2.0g、乙酸钠25g、硫酸镁0.575g、硫酸锰0.12g、亚硫酸铁0.034g、吐温80 1.0g、葡萄糖20g、琼脂15.0g、ph值5.5
±
0.225℃，加蒸馏水定容至1l。
32.步骤二、取酒曲10g，用无菌蒸馏水稀释至10-5
，涂布于乳酸菌选择性琼脂培养皿上，37℃好氧培养；
33.步骤三、37℃好氧培养48h后，挑取单菌落，三区划线纯化3次，得到纯化培养细菌；
34.步骤四、提取纯化培养细菌dna，利用pcr技术扩增16s rdna序列，通过序列比对，确定为任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)新菌种。
35.二、任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)的鉴定
36.任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)，对菌种的进行形态学、生理生化、细胞化学及基因水平研究。
37.1、任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)的细胞形态及生理生化特征检测
38.任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)菌落形态为圆形，凸起，淡黄；革兰氏反应阳性，为革兰氏阳性菌，最适温度为37℃，生长ph为7-8，可以水解淀粉，过氧化氢酶阳性。
39.如图1所示为任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)的透射电镜图，鉴定结果显示，细胞非孢子形成，不具有运动性，为不规则形状的杆状细胞(1-1.5μm)
×
0.7μm。
40.2、任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)的细胞化学特征检测
41.通过gc气相谱、hplc液相谱和tlc薄层谱检测任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)的脂肪酸、醌类型、极性脂等细胞化学组分(sasser m.identification of bacteria by gas ghromatography of cellular fatty acids，midi technical note 101.newark,de:midiinc；1990.minnikin de,o’donnell ag,goodfellow m,alderson g,athalye m et al.anintegrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones andpolar lipids.j microbiol methods 1984；2:233
–
241)。
42.任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)的细胞脂肪酸成分检测如表1所示，结果显示任清短杆菌的主要脂肪酸是antesio-c15:0(反异式十五碳饱和脂肪酸)，antesio-c17:0(反异式十七碳饱和脂肪酸)，iso-c16:0(异式十六碳饱和脂肪酸)，iso-c17:0(异式十七碳饱和脂肪酸)。细胞脂肪酸成分如表1所示。
43.表1
44.45.如图2所示，在菌株任清短杆菌细胞呼吸醌组份检测，该菌株的主要甲基萘醌为mk-8(h2)，醌类化合物是一类广泛存在于自然产物、抗肿瘤药物、体内生化代谢物、环境污染物或多环芳烃代谢产生的氧化活性物质。每种细菌都有一个主要的醌类组分，一个微生物体中的醌类种类和数量的不同反映了体组成的多样性，醌类谱已经作为细菌体组成多样性的一个指标，在环境微生物中广泛使用。
46.任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)极性酯的检测，具体步骤为：极性脂提取：取100mg任清短杆菌冻干菌体，悬浮于9.5ml氯仿：甲醇：0.3％nacl(2.5:5:2)溶液中。将上述菌体溶液放置80℃水浴，15min。冷却后，滤纸过滤至50ml离心管中，加入2.5ml氯仿和2.5ml 0.3％nacl，4000rpm离心5min。小心分取下层氯仿相至干净的旋转蒸发仪专用烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发除去氯仿，水浴温度不超过40℃。加入250μl氯防-甲醇(2:1，v/v)转至棕螺口样品瓶中，放置4℃冰箱中保存待测。
47.极性脂的tlc分析：将10cm
×
10cm的硅胶板(merck公司25tlc aluminiumn sheets 20cm
×
20cm silica gel 60f254)在110℃烘箱中活化1小时,取出冷却。吸取2μl总脂样品点样于tlc板上，复点样3次。
48.将tlc薄板置于第一个层析缸内展层，第一向展层剂为氯仿:甲醇:水(65:25:4，v/v)，溶媒展至顶部后取出薄板吹干、将薄板放入第二个层析缸，第二向展层剂为氯仿：甲醇：乙酸：水(80：12：15：4，v/v)，按与第一向垂直的方向上行，溶媒展至顶部取出薄板吹干，将磷钼酸显剂喷洒至tlc板至完全湿润，100℃加热5-8min，将清晰斑点显出，立即在扫措仪上扫描tlc板，记录结果。如图4所示，在任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)中，含有4种极性酯，dpg：双磷脂酰甘油，diphosphatidylglycerol；pg：磷脂酰甘油，phosphatidylglycerol；gpl：糖磷脂，glycophospholipid；pl：磷酸类脂，phospholipids。磷酸类脂(phospholipioides)属极性脂(polar lipid)，与蛋白质、糖等构成细胞膜，对于物质运输、代谢及维持正常的渗透压都有重要作用。不同属菌的磷酸类脂组分是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可缺少的分类指征。
49.3、菌株系统进化地位的确定
50.任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)，即brevibacterium renqingensis ren4
t
菌株由上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序，得到全基因组序列。系统进化树如图3所示。
51.将测得的ren4
t 16s rrna序列在ncb(ihttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中与模式菌株进行比对，根据相似度(97.00
–
98.00％)选取14个模式菌株16s rrna序列进行系统进化树的构建，如图3所示，ren4
t
与短杆菌属的亲缘距离相近，且在系统进化树中为独立分支，确定其为短杆菌属，同时根据相似度(97.85％)得知其相似株为brevibacterium epidermidis ncimb 702286t。接着将ren4
t
菌株送往上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序，得到全基因组序列。同时从ncbi中下载相似株全基因组，将ren4
t
全基因组与相似株brevibacterium epidermidis ncimb 702286t在dsmz(http://ggdc.dsmz.de/home.php)进行全基因组比对，基因组dna-dna同源性杂交(ddh)：dna值＝48％，其中，按照ddh值《70％确定为新种，因此初步确定为新种。
52.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，
在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
53.54.

技术特征：

1.菌株，其特征在于，所述菌株为任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.19203。2.一种菌剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述的菌株。3.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂在如下(a1)或(a2)中的应用：(a1)产生风味物质；(a2)制备具有风味物质的产品。4.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂在如下(b1)或(b2)中的应用：(b1)酿酒；(b2)制备酿酒产品。5.权利要求1所述的菌种在制备权利要求1所述菌剂中的应用。6.菌株，其特征在于，所述菌株为任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)中菌株，所述任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)中菌株的16s rdna序列与seq id no.1相比至少具有98.7％以上的相似性。7.权利要求6所述菌株的筛选方法，其特征在于，将酒曲稀释后涂布于乳酸菌琼脂培养基上，37℃好氧培养48h，三区划线纯化培养3次，得到纯培养细菌，将所述纯培养细菌pcr技术扩增16srdna，对序列对比分析，得到所述任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)。8.如权利要求7所述的菌株的筛选方法，其特征在于，所述乳酸菌培养基包括以下质量份数的原料：胰酪蛋白胨8-12份、酵母浸粉4-8份、磷酸二氢钾4-8份、柠檬酸胺1-4份、乙酸钠20-30份、硫酸镁0.2-0.8份、硫酸锰0.05-0.2份、亚硫酸铁0.01-0.04份、吐温80 0.5-2份、葡萄糖15-25份、琼脂10-20份，蒸馏水定容至1000份。

技术总结

本发明公开了任清短杆菌新菌种及其应用，所述菌株为任清短杆菌(Brevibacterium renqingensis)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.19203。试验证明，本发明提供一株新菌种任清短杆菌(Brevibacterium renqingensis)，该菌株分离自酿酒窖泥，其能够产生清香风味物质，可用于发酵酿酒。可用于发酵酿酒。可用于发酵酿酒。