⽤考马斯亮蓝G250法测定蛋⽩质含量呵呵
你的⾃⼰检查⼀下你的仪器
蛋⽩质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染⾊法⽬的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋⽩质浓度的原理和⽅法。实验原理考马斯亮蓝法测定蛋⽩质浓度，是利⽤蛋⽩质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋⽩浓度的快速、灵敏的⽅法。 考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜⾊形式，红⾊和蓝⾊。它和蛋⽩质通过范德华⼒结合，在⼀定蛋⽩质浓度范围内，蛋⽩质和染料结合符合⽐尔定律(Beer’s law)。此染料与蛋⽩质结合后颜⾊有红⾊形式和蓝⾊形式，最⼤光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋⽩质的量。
蛋⽩质和染料结合是⼀个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最⼤光吸收，并可稳定1h，之后，蛋⽩质―染料复合物发⽣聚合并沉淀出来。蛋⽩质―染料复合物具有很⾼的消光系数，使得在测定蛋⽩质浓度时灵敏度很⾼，在测定溶液中含蛋⽩质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，⽐Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋⽩质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋⽩质。此反应重复性好，精确度
⾼，线性关系好。标准曲线在蛋⽩质浓度较⼤时稍有弯曲，这是由于染料本⾝的两种颜⾊形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋⽩质结合⽽不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此⽅法⼲扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，⼄醇，(NH4)2SO4⽆⼲扰。强碱缓冲液在测定中有⼀些颜⾊⼲扰，这可以⽤适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，⼄酸，2―巯基⼄醇，蔗糖，⽢油，EDTA及微量的去污剂如Triton
X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜⾊⼲扰，⽤适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，⼤量去污剂的存在对颜⾊影响太⼤⽽不易消除。试剂与器材⼀、试剂考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%⼄醇中，加⼊100ml85%磷酸，⽤蒸馏⽔稀释⾄1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，
4.7%(W/V)⼄醇。⼆、标准和待测蛋⽩质溶液 1(标准蛋⽩质溶液
结晶⽜⾎清蛋⽩，预先经微量凯⽒定氮法测定蛋⽩氮含量，根据其纯度⽤
0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，
0.1mg/ml蛋⽩溶液。
2(未知蛋⽩质溶液。三、器材试管及试管架，移液管(0.1ml及5ml)，UV,2000型分光光度计。操作⽅法⼀、标准法制定标准曲线
取14⽀试管，分两组按下表a平⾏操作。
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋⽩含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
表a
试管编号
1
2
3
4
5
6
1mg/ml标准蛋⽩溶液/ml 0
0.01
0.02
0.03
0.05
0.06
0.15mol/L NaCl/ml
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
考马斯亮蓝试剂/ml 5ml
摇匀，1h内以0号管为空⽩对照，在595nm处⽐⾊
A595nm
⼆、微量法制定标准曲线取12⽀试管，分两组按下表b平⾏操作。
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋⽩含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表b
试管编号
1
2
3
4
5
1mg/ml标准蛋⽩溶液/ml 0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.15mol/L NaCl/ml
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
考马斯亮蓝试剂/ml
5ml
摇匀，1h内以0号管为空⽩对照，在595nm处⽐⾊
A595nm
三、未知样品蛋⽩质浓度测定
测定⽅法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋⽩的量，从⽽计
算出未知样品的蛋⽩质浓度(mg/ml)。注意事项(1) 如果测定要求很严格，可以在试剂加⼊后的5,20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜⾊是最稳定的。
(2) 测定中，蛋⽩，染料复合物会有少部分吸附于⽐⾊杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可⽤⼄醇将蓝⾊的⽐⾊杯洗⼲净。
思考题:
根据下列所给的条件和要求，选择⼀种或⼏种常⽤蛋⽩质定量⽅法测定蛋⽩质的浓度:
(1) 样品不易溶解，但要求结果较准确。
(2) 要求在半天内测定60个样品。
(3) 要求很迅速地测定⼀系列试管(30⽀)中溶液的蛋⽩质浓度。
不要⽤⽐⾊杯，⽤量⼤，重复性差。
可以这样在96孔板⾥⾯做(可以做复孔):
每孔200微升Bradford试剂，加5微升蛋⽩溶液，⽤混匀或着在微量振荡器上⾯振匀。 5分钟后在酶
标仪上测定OD495，然后在Excel⾥⾯直接做均值，画标准曲线，OK～参考:Pierce公司的相关试剂盒。
考马斯亮兰法(Bradford法)
(⼀)实验原理
1976年由Bradford建⽴的考马斯亮兰法(Bradford法)，是根据蛋⽩质与染料相结合的原理设计的。这种蛋⽩质测定法具有超过其他⼏种⽅法的突出优点，因⽽正在得到⼴泛的应⽤。这⼀⽅法是⽬前灵敏度最⾼的蛋⽩质测定法。考马斯亮兰
G-250染料，在酸性溶液中与蛋⽩质结合，使染料的最⼤吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜⾊也由棕⿊⾊变为兰⾊。经研究认为，染料主要是与蛋⽩质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳⾹族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋⽩质浓度成正⽐。
Bradford法的突出优点是:
(1)灵敏度⾼，据估计⽐Lowry法约⾼四倍，其最低蛋⽩质检测量可达1mg。这是因为蛋⽩质与染料结合后产⽣的颜⾊变化很⼤，蛋⽩质，染料复合物有更⾼的消光系数，因⽽光吸收值随蛋⽩质浓度的变化⽐Lowry法要⼤的多。
(2)测定快速、简便，只需加⼀种试剂。完成⼀个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋⽩质结合的过程，⼤约只要2分钟即可完成，其颜⾊可以在1⼩时内保持稳定，且在5分钟⾄20分钟之间，颜⾊的稳定性最好。因⽽完全不⽤像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)⼲扰物质少。如⼲扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离⼦、Tris缓冲液、糖和蔗糖、⽢油、巯基⼄醇、EDTA等均不⼲扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋⽩质中的精氨酸和芳⾹族氨基酸的含量不同，因此Bradford法⽤于不同蛋⽩质测定时有较⼤的偏差，在制作标准曲线时通常选⽤ g—球蛋⽩为标准蛋⽩质，以减少这⽅⾯的偏差。
(2)仍有⼀些物质⼲扰此法的测定，主要的⼲扰物质有：去污剂、 Triton X-100、⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸⼲扰Lowary法⼀样)。
(3)标准曲线也有轻微的⾮线性，因⽽不能⽤Beer定律进⾏计算，⽽只能⽤标准曲线来测定未知蛋⽩质的浓度。
这是操作流程
g蛋
1. 完全溶解蛋⽩标准品，取10ml稀释⾄100ml ，使终浓度为0.5mg/ml。蛋⽩样品在什么溶液中，标准品也宜⽤什么溶液稀释。
但是为了简便起见，也可以⽤0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
2. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升分别加到96孔板中，加标准品稀释液补⾜到20微升(⼀般每个梯度做五个)。
3. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20微升。
4. 各孔加⼊200微升G250染⾊液，室温放置3-5分钟。
5. ⽤酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。
6. 根据标准曲线计算出样品中的蛋⽩浓度。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议