一种兼具化疗及光动力联合疗效的共价铂药/卟啉囊泡及其构筑方法和应用

1.本发明属于生物材料领域，具体涉及一种兼具化疗及光动力联合疗效的共价铂药/卟啉囊泡及其构筑方法和应用。

背景技术：

2.癌症已成为最严重的全球健康问题之一，对人类健康产生了严重的威胁。迄今为止，癌症仍然是一个世界性的问题，目前癌症的方法有放射、化疗、光疗、免疫和基因等。单一疗法效果有限，而相对的联合方案通常结合两种或两种以上的药物，这些药物具有协同作用，可以降低过程中的毒副反应，克服耐药性，提高肿瘤效果。
3.铂类药物在化疗中占有举足轻重的地位。包括顺铂、卡铂、奥沙利铂等在内的铂类药物已被fda批准作为临床抗癌药，在临床中显示了较好的抗肿瘤效果并在世界范围内被接受，其作用机理在于通过与dna结合来阻碍肿瘤细胞的分裂。但由于其较大的毒副作用以及耐药性限制了其应用。
4.光动力疗法(pdt)是一种新颖的抗肿瘤方法，其过程主要涉及氧气、光敏剂和光。光敏剂在特定波长的光照射后将其能量转移到氧分子中，产生的高活性单线态氧具有细胞毒性，可以造成细胞肿瘤的损伤。因此pdt具有区域选择性，同时副作用轻微，已逐步成为肿瘤的基本手段之一。卟啉分子是一类具有独特结构的有机杂环分子，具有独特的化学、光物理特性，在临床光动力及肿瘤成像方面均具有重要的应用价值。然而其分子本身溶解性较差、不易在病灶富集的缺点，限制了其在生物医学领域的应用。通过整合卟啉理化特性与纳米尺寸效应，开发卟啉纳米材料，不仅能够增强卟啉的光动力效果，同时能够扩展卟啉在医药领域的应用前景。
5.目前，开发纳米材料进行肿瘤的化疗、光动力联合的策略有着极大的潜力。因此，本发明首次将铂类前药和特定卟啉衍生物作为构筑基元，通过交替共聚获得单分子层囊泡结构。一方面，其具有肿瘤微环境gsh响应的铂药释放行为，并且药物的释放速率可以通过加入的铂类前药含量进行调节。另一方面，囊泡结构中卟啉基元具有优异的光动力特性，其能够通过光照产生的单线态氧增强细胞内氧化应激水平，进而调节铂药释放速率及增强药物的化学敏感性。因此设计合成的单分子层囊泡整体具有化疗及光动力的肿瘤协同功能。同时，单分子层囊泡的空心结构可以负载其他药物分子，作为多重药物联合的药物递送体系。

技术实现要素：

6.本发明的第一个目的是为针对现有技术的不足，提供了一种兼具化疗/光动力联合疗效铂/卟啉囊泡。本发明通过共价自组装的方式将铂前药与卟啉分子组成囊泡作为肿瘤药物递送系统，发挥联合疗效的同时还能够作为载体负载质粒、酶及小分子化合物等，进
一步提高肿瘤效果。
7.本发明铂/卟啉囊泡，其直径在100nm～200nm，囊泡壁的厚度为1nm-2nm，包括由铂类药物前体和卟啉ⅳ基于共价自组装方式形成的囊泡；其中铂类药物前体的结构式如式i或式ⅱ及式ⅲ：
[0008][0009]
n为-ch
2-个数，1≤n≤4。
[0010][0011]
可以通过调节铂类药物前体与卟啉的比例或调节转速，可获得具有不同药物释放速度以及不同大小的单分子层囊泡。
[0012]
本发明的第二个目的是提供一种铂/卟啉囊泡的制备方法，具体包括以下步骤：
[0013]
(1)将铂前药、催化剂、配位溶剂配置得到一定浓度的含铂溶液；然后在适宜温度条件下加入含卟啉溶液a，继续搅拌一段时间，获得单分子层囊泡溶液；
[0014]
所述含卟啉溶液为卟啉与配位溶剂的混合液；
[0015]
(2)收集步骤(1)所述单分子层囊泡溶液：
[0016]
将步骤(1)中单分子层囊泡溶液在低温下进行透析，进一步浓缩后即可得到纯化的单分子层囊泡。
[0017]
优选的，所述铂前药与卟啉的摩尔比为1～8:1，优选为1～2:1。
[0018]
优选的，所述所述配位溶剂为氯化溶剂、醇溶剂中的一种或两种；其中氯化溶剂为二氯甲烷、氯仿；醇溶剂为甲醇或乙醇。
[0019]
优选的，步骤(1)反应的温度为25℃，搅拌时间为24h；
[0020]
优选的，步骤(1)透析的温度为4℃。
[0021]
本发明的第三个目的是提供铂/卟啉囊泡作为药物载体上的应用。本发明提供的载药囊泡能同时装载不局限质粒、酶及小分子化合物的药物，能够使药物达到肿瘤部位并进入癌细胞发挥功能。
[0022]
本发明的第四个目的是提供一种兼具化疗/光动力联合疗效剂，包括铂/卟啉囊泡；
[0023]
作为优选，还可以包括装载在铂/卟啉囊泡内的抗肿瘤药物，采用以下方法制备得到：
[0024]
在含卟啉溶液a中加入一定用量的抗肿瘤药物，得到含卟啉溶液b；
[0025]
在适宜温度条件下，含铂溶液和含卟啉溶液b混合，搅拌一段时间，获得装载有抗肿瘤药物的单分子层囊泡溶液；
[0026]
将单分子层囊泡溶液在低温下进行透析，进一步浓缩干燥即可得到装载有抗肿瘤药物的单分子层囊泡。
[0027]
更为优选，所述抗肿瘤药物为质粒、酶或小分子化合物。
[0028]
本发明提供的囊泡载体能同时具有化疗、光动力联合效果，递送至肿瘤部位后通过gsh响应解体释放出fda批准的铂类临床抗癌药以及卟啉分子，通过化疗以及光动力实现对肿瘤的双重打击，达到高效抑制肿瘤甚至清除肿瘤的目的。
[0029]
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0030]
本发明制备的铂/卟啉囊泡同时含有含铂类药物的柔性链以及卟啉结构的构筑单元，可协同消杀肿瘤细胞，达到多位一体的给药效果。释放的铂类药物均为fda批准的临床抗癌药，在临床中显示了较好的抗肿瘤效果，因此囊泡作为化疗、光动力肿瘤的药物递送体系具有广阔应用前景。
[0031]
本发明中，该囊泡具有生物分子响应能力，在gsh的存在下，囊泡解体，释放出铂类药物以及卟啉起到作用。并且通过调节加入铂类药物的柔性链的量，可制备具有不同药物释放速度的囊泡。
[0032]
本发明中，装载其它抗肿瘤药物的单分子囊泡仍具有gsh响应能力。发生刺激响应后囊泡解体释放出装载分子，这对于药物的输送、防止药物提前泄漏并延长药物作用时间具有重要的意义。
[0033]
本发明提供的铂/卟啉囊泡具有多种调节手段，使得形成的囊泡的可调节性好，且具有良好的稳定性，有利于该类型囊泡作为载体的进一步的应用。
附图说明
[0034]
图1为本发明式ⅰ铂类药物前体的核磁共振氢谱图；
[0035]
图2为本发明式ⅳ氨基卟啉的核磁共振氢谱图；
[0036]
图3(a)-(b)分别为本发明实施例2-1获得铂/卟啉囊泡粒径分布图以及tem图；
[0037]
图4为本发明实施例2-2获得铂/卟啉囊泡tem图；
[0038]
图5为本发明实施例2-3获得铂/卟啉囊泡sem图；
[0039]
图6为本发明实施例2-1获得铂/卟啉囊泡对gsh响应后的铂药释放行为图；
[0040]
图7为本发明实施例2-1、2-2、2-3获得不同摩尔比投料铂/卟啉囊泡在相同条件下的铂药释放行为图；
[0041]
图8为本发明实施例2获得铂/卟啉囊泡的细胞毒性实验结果。
具体实施方式
[0042]
为了进一步理解本发明，下面通过具体实施方式对本发明进行详细的描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0043]
本发明提供了式i、式ⅱ、式ⅲ铂类药物前体和式ⅳ氨基卟啉以及铂/卟啉囊泡。铂/卟啉囊泡主要包括由铂类药物前体和卟啉基于共价自组装方式形成。
[0044][0045]
n为-ch
2-个数1≤n≤4。
[0046][0047]
本发明提供了铂/卟啉囊泡的制备方法，具体而言，将铂类药物前体与催化剂和组装溶剂配置得到一定浓度的含铂溶液；然后在适宜温度条件下加入含卟啉的组装溶剂，继续搅拌一段时间，获得单分子层囊泡溶液；将上述配合物单分子层囊泡溶液在低温下进行透析，进一步浓缩后，即可得到单分子层囊泡。
[0048]
同时本发明铂/卟啉囊泡亦可负载其他类型的药物，如：质粒、烷化剂类、蛋白多肽类药物等。应当说，该铂/卟啉囊泡是一个可用于通用的药物负载平台，能够根据需求调整药物类别、释放时间等。
[0049]
铂/卟啉囊泡在gsh作用下具有的释放行为，能将囊泡的构筑基元以及负载的药物释放出来，在不同gsh浓度下调控药物的释放行为。
[0050]
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的式i、式ⅱ、式ⅲ铂类药物前药、铂/卟啉囊泡及其制备方法进行详细描述。
[0051]
首先制备铂类药物前药；具体包括如下步骤：
[0052]
实施例1-1：铂类药物前体的制备
[0053]
将0.3g顺铂、卡铂或奥沙利铂分散在10ml去离子水中，机械搅拌15min，再加入10ml30％过氧化氢溶液，继续搅拌12小时。过滤得到淡黄固体产物(1)0.3g；将产物(1)溶于干燥的dmso溶液，之后再加入0.2g丁二酸酐，在n2保护下70℃油浴12小时。除去溶剂，并用大量乙醚沉降，过滤后再多次用水洗涤，干燥即可分别得到式i，式ⅱ，式ⅲ；
[0054]
以氘代二甲基亚砜为溶剂，n＝2时，式ⅰ的1h-nmr图谱如图1所示。
[0055]
实施例1-2：式ⅳ氨基卟啉的制备
[0056]
将取1g对硝基苯甲醛溶于90ml丙酸中，搅拌至溶液澄清后加入1ml乙酸酐，除氧后140℃加热回流。15min后加入溶于10ml丙酸的600mg吡咯，继续回流2小时。旋蒸除去溶剂后，再与30ml吡啶在120℃下回流1h，冷却过滤得到紫罗兰固体产物(2)0.2g；将产物(2)与0.2g锡粉混合溶于适量浓盐酸中，并在50℃下回流3小时。之后在低温下调节溶液ph至8～9。过滤后再用氯仿：甲醇＝1：1层析柱提纯，得到式ⅳ氨基卟啉；
[0057]
以氘代二甲基亚砜为溶剂，式ⅳ的1h-nmr图谱如图2所示。
[0058]
然后利用实施例1-1至1-2制备得到铂/卟啉囊泡；具体如下：
[0059]
实施例2-1：铂/卟啉囊泡的制备
[0060]
将3mg实施例1-1式ⅰ所示铂类药物前体溶于5ml乙醇，加入n,n'-二环己基碳二亚
胺(dcc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)催化剂并搅拌10min，制得含铂溶液；将0.5mg氨基卟啉溶于5ml氯仿制得卟啉溶液，在转速200rpm下搅拌，常温条件下将卟啉溶液加到含铂溶液中，搅拌24小时。于4℃下透析12小时，浓缩干燥后得到铂/卟啉囊泡溶液。
[0061]
利用纳米粒度仪和透射电镜对得到的囊泡进行形态以及粒径表征，如图3所示，从图中可以看出，制备得到囊泡呈球形，颗粒大小较均一，粒径分布为100-200nm，平均粒径约为180nm，分散指数(pdi)为0.15。
[0062]
实施例2-2：铂/卟啉囊泡的制备
[0063]
将6mg实施例1-1式ⅰ所示铂类药物前体溶于5ml乙醇，加入n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)催化剂并搅拌10min，制得含铂溶液；将0.5mg氨基卟啉溶于5ml氯仿制得卟啉溶液，在转速200rpm下搅拌，常温条件下将卟啉溶液加到含铂溶液中，搅拌24小时。于4℃下透析12小时，浓缩干燥后得到铂/卟啉囊泡溶液。
[0064]
通过透射电镜观察囊泡，如图4中所示，囊泡直径约为100nm，壁厚约为1.2nm。
[0065]
实施例2-3：铂/卟啉囊泡的制备
[0066]
将3mg实施例1-1式ⅰ所示铂类药物前体溶于5ml乙醇，加入n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)催化剂并搅拌10min，制得含铂溶液；将1mg氨基卟啉溶于5ml氯仿制得卟啉溶液，在转速200rpm下搅拌，常温条件下将卟啉溶液加到含铂溶液中，搅拌24小时。于4℃下透析12小时，浓缩干燥后得到铂/卟啉囊泡溶液。
[0067]
利用扫描电镜对得到的囊泡进行形态表征，如图5中所示，囊泡直径约为200nm。
[0068]
实施例2-4：铂/卟啉囊泡的制备
[0069]
将3mg实施例1-1式ⅱ所示铂类药物前体溶于5ml乙醇，加入n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)催化剂并搅拌10min，制得含铂溶液；将1mg氨基卟啉溶于5ml氯仿制得卟啉溶液，在转速200rpm下搅拌，常温条件下将卟啉溶液加到含铂溶液中，搅拌24小时。于4℃下透析12小时，浓缩干燥后得到铂/卟啉囊泡溶液。
[0070]
实施例2-5：铂/卟啉囊泡的制备
[0071]
将3mg实施例1-1式ⅰ所示铂类药物前体溶于5ml乙醇，加入n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)催化剂并搅拌10min，制得含铂溶液；将0.5mg氨基卟啉溶于5ml氯仿制得卟啉溶液，在转速500rpm下搅拌，常温条件下将卟啉溶液加到含铂溶液中，搅拌24小时。于4℃下透析12小时，浓缩干燥后得到铂/卟啉囊泡溶液。
[0072]
实施例3：铂/卟啉囊泡对gsh响应后的铂药释放行为
[0073]
将本发明实施例2-1制备的携带的铂/卟啉囊泡，装入透析袋，透析袋外液为pbs、1mmgsh或10mmgsh溶液并机械搅拌24小时以上，每隔一定时间间隔取外液测定pt元素含量，即可得到铂/卟啉囊泡在pbs、1mmgsh或10mmgsh下的药物释放曲线。
[0074]
利用等离子体发射光谱仪icp检测铂药的释放行为，如图6所示。
[0075]
实施例4：铂/卟啉囊泡对gsh响应后的铂药释放行为
[0076]
将本发明实施例2-1、2-2、2-3制备的携带的铂/卟啉囊泡，装入透析袋，透析袋外液为pbs、1mmgsh溶液并机械搅拌4小时以上，每隔一定时间间隔取外液测定pt元素含量，即可得到不同配比制得的铂/卟啉囊泡在相同条件下的药物释放曲线。
[0077]
利用等离子体发射光谱仪icp检测铂药的释放行为，如图7所示。
[0078]
实施例5：携带ido抑制剂的铂/卟啉囊泡的制备
[0079]
将3mg实施例1-1式ⅰ所示铂类药物前体溶于5ml乙醇，加入n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)催化剂并搅拌10min，制得含铂溶液；将0.5mg氨基卟啉与ido抑制剂nlg919混合溶于5ml氯仿制得卟啉溶液，在转速200rpm下搅拌，常温条件下将卟啉溶液加到含铂溶液中，搅拌24小时。于4℃下透析12小时，浓缩干燥后得到携带ido抑制剂的铂/卟啉囊泡溶液。
[0080]
实施例6：铂/卟啉囊泡构建的抗癌体系的抗癌效果评估
[0081]
以小鼠乳腺癌细胞(4t1)为模型，利用mtt实验检验实施例2单分子囊泡的对癌细胞的毒性。在载体兼具化疗及光动力性能的条件下，不另外负载其他药物，将该囊泡和4t1细胞共培养，然后用培养液洗去没有进入细胞的囊泡，再使用660nm红外光照射进行不同处理，利用mtt实验来检验铂/卟啉囊泡对癌细胞的杀伤效果(图8)。在无光照的条件下，单分子层囊泡的铂类药物起化疗作用，对癌细胞有一定的杀伤作用。在光照的条件下，囊泡的铂类药物与卟啉基元同时起着化疗与光动力联合的作用，癌细胞的存活率进一步降低。因此单分子层囊泡有着联合的效果，可以装载大量光敏剂并运输至肿瘤部位，同时缓解了化疗药物耐药性的问题；延长血液循环时间；单一体系具有多功能性，具有较好的肿瘤效果。
[0082]
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种单分子层囊泡，直径为100nm～200nm，囊泡壁的厚度为1nm-2nm，其特征在于，所述单分子层囊泡包括由铂类药物前体和卟啉ⅳ基于共价自组装方式形成的囊泡；其中铂类药物前体的结构式如式i或式ⅱ及式ⅲ：其中n为自然数，1≤n≤4；2.权利要求1所述的一种单分子层囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将铂前药、催化剂、配位溶剂配置得到一定浓度的含铂溶液；然后在适宜温度条件下加入含卟啉溶液a，继续搅拌一段时间，获得单分子层囊泡溶液；所述含卟啉溶液为卟啉与配位溶剂的混合液；(2)将步骤(1)中单分子层囊泡溶液在低温下进行透析，进一步浓缩后即可得到纯化的单分子层囊泡。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述铂前药采用顺铂、卡铂、奥沙利铂中的一种。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述铂前药与卟啉的摩尔比为1～8:1。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述铂前药与卟啉的摩尔比为1～2:1。6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述所述配位溶剂为氯化溶剂、醇溶剂中的一种或两种；其中氯化溶剂为二氯甲烷、氯仿；醇溶剂为甲醇或乙醇。7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)反应的温度为25℃，搅拌时间为24h。8.如权利要求1所述的一种单分子层囊泡作为药物载体上的应用。9.一种兼具化疗/光动力协同疗效剂，其特征在于包括权利要求1所述的一种单分子层囊泡。10.如权利要求9所述的一种兼具化疗/光动力协同疗效剂，其特征在于，还可以包括装载在铂/卟啉囊泡内的抗肿瘤药物。

技术总结

本发明公开一种兼具化疗及光动力联合疗效的共价铂药/卟啉囊泡及其构筑方法和应用。本发明提供的铂/卟啉囊泡外层含有铂类药物前体和卟啉分子，在保持化疗的基础上，同时赋予囊泡光动力性能，光动力与化疗的协同作用刺激机体氧化应激，释放活性氧对肿瘤进行杀伤，降低过程中的毒副反应，克服耐药性，并长效抑制肿瘤。本发明提供的GSH响应囊泡具有GSH响应性，且药物的释放速度可通过铂药和卟啉调节，同时内部的空腔可以装载其他分子，囊泡达到肿瘤部位后，GSH的变化使其解体，释放出铂类药物和卟啉以及装载的其他分子发挥协同作用，可以进行肿瘤的多重药物联合，构建出高效安全稳定的抗癌系统，有着良好的应用前景。前景。前景。