一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法

1.本发明属于育种技术领域，具体涉及一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法。

背景技术：

2.水稻是我国主要粮食作物。传统的水稻移栽方式已无法适应新的耕作形式，直播、机插秧等轻简栽培模式已经大面积推广，成为本地水稻种植主要模式。与传统的栽培模式相比，水稻轻简栽培模式简化水稻栽培程序，节省了大量的人力、物力和财力，综合经济效益较高；但稻田草害重的问题尤为突出，如何高效、快速的防治田间草害，成为制约规模化发展的主要因素之一。因此，轻简化栽培对水稻品种的要求越来越高，选育更加适宜规模化生产的抗除草剂水稻新品种显得尤为重要。
3.目前，国内非转基因抗除草剂水稻育种研究，所用除草剂的靶标主要有5
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烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯合成酶(epsps)、乙酰辅酶a羧化酶(accase)、乙酰乳酸合成酶(als)及对羟苯基丙酮酸双氧化酶(hppd)等。其中，乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,als)是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸合成中的关键酶，是多种除草剂的作用靶标。其原理是als抑制剂类除草剂与植物体内的als结合形成复合物，阻断底物进入酶活性位点通路，抑制als 活性，使支链氨基酸合成受阻，导致蛋白质的合成受到抑制，最终致使植物生长和发育停止、直至死亡。最为典型的品种是天津农科院选育的金粳616等。
4.江苏的水稻面积3300万亩，其中粳稻面积在2800万亩左右。近年来抗除草剂水稻新品种金粳818、津粳565等抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种在苏中、苏北地区推广迅猛，解决了直播稻田杂草多、杂草稻难以防除等困境，短时间内农民生产成本迅速减低。
5.目前，多数育种单位的抗除草剂水稻育种主要是通过实验室分子标记检测。需要提取水稻基因组dna，克隆als基因，然后通过pcr技术进行扩增，最终获取的产物，并对产物进行基因测序，分析该产物与数据库序列差异，确定抗性靶标(周延彪，2019)。该实验室鉴定方法优点：是否抗除草剂准确率高；缺点是工作量大，操作繁琐，操作成本高。
6.国内抗除草剂研究另外一种鉴定方法是田间鉴定。就是将育种材料种植于田间，通过喷施咪唑啉酮类等除草剂，让不抗除草剂的育种材料自然死亡(任艳，2021)。缺点是：如果在施药前后，田间长时间淹水，根系呼吸功能下降，其生理代谢能力减弱，容易发生药害。另一方面使用除草剂，被土壤吸附后，有可能持续危害稻苗，甚至对下茬作物影响显著。

技术实现要素：

7.针对背景技术提出的问题，本发明研究设计了一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法，通过培养皿育秧，在水稻秧苗期(3叶期前)转移至含有除草剂的培养皿中，保持稻苗根深入培养基中，充分吸收营养。在培养箱中培养10天后，将成活的水稻秧苗(进入体内的药物已大量代谢降解)移栽到本田，建立水层，再进行水稻育种中后期其它性状鉴定。
8.本发明的技术解决方案：
9.一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法，其特征在于：包括以下步骤：
10.1)育秧辅助材料准备
11.选用水稻专用塑料软盘平铺在同规格的硬盘内；
12.2)配置营养基质
13.固体ms培养基(一种植物培养基)中加入1％琼脂，去离子水定容ms培养基至1l，高温高压灭菌；
14.3)标记培养皿
15.分批配置营养基质，一批在培养皿中加入20ml ms培养基，待其凝固，另外一批在培养皿内加入相应的咪唑啉酮类除草剂，用黑油墨笔在培养皿上标记水稻材料编号；
16.4)育种材料播种
17.将需要进行除草剂抗性鉴定的水稻育种材料按品系序号对应均匀播在不含除草剂的培养皿内，每皿种子播种量不超过5克，以利壮苗；
18.5)培养皿封口
19.将播种完成的培养皿用塑料薄膜封口，防止其他病菌落入培养皿，同时保温；
20.6)适时更换培养基
21.培养基支持水稻苗5-8天生成所需的营养，5-8天之后需要更换新的培养基，水稻幼苗发芽进入3叶期前转移至含有除草剂的培养基中；
22.9)秧苗抗性记载
23.在含有除草剂的培养基内生成5-6天，即可发现稻苗生长产生差异，10天进行秧苗除草剂抗性记载，秧苗完全不受影响的标记“√”；秧苗部分受影响的标记
“”
；秧苗完全萎缩死亡的标记
“×”
号；
24.10)抗性秧苗移栽
25.将标记“√”与
“”
的培养基运到田间按品系序号单苗进行栽插，进行常规管理，每个品系记录生育期、株高、株型等基本农艺性状，成熟后进行单株田间选择，室内考种决选。
26.所述步骤1)中水稻专用塑料软盘规格为28cm
×
58cm
×
3cm。
27.所述步骤2)中固体ms培养基为ms粉末4.3g，nacl 1g。
28.所述步骤2)中灭菌温度为121℃，压力为1.05kg/cm2，灭菌时间为20min。
29.所述步骤10)中每个品系栽植3行，每行10株，株距为15cm，行距为25.0cm。
30.本发明的有益效果：本发明提供的利用培养基育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法，一方面快速准确鉴定水稻抗除草剂性能，加速抗除草剂水稻新品种选育进程；另一方面避免田间使用除草剂对水体和土壤的污染，避免其它不抗除草剂品种受到的影响。选育出的水稻品种可以很好地服务于直播、机插等轻简化栽培，对实现乡村振兴，提升“苏米”品牌战略有积极的推动作用。
附图说明
31.图1为利用除草剂筛选，不携带抗性靶标基因的幼苗生长情况。
32.图2为利用除草剂筛选，携带抗性靶标基因的幼苗生长情况。
33.图3为利用除草剂筛选，更换营养基质的幼苗生长情况。
具体实施方式
34.以下结合具体实施例对本发明做一步说明。
35.(1)2019年正季，在泗阳育种基地以抗除草剂品种金粳818为母本，以本单位自育品系泗稻2096为父本杂交配组，收获杂交种f0；
36.(2)2019年冬-2020年春，步骤(1)收获f0海南崖州南滨农场加代，种植编号为繁168，表现丰产性好、米质优，混收f1，分成两份，一份常规水育秧，一份利用培养皿育秧，作抗除草剂试验；所述培养皿为固体ms培养基中(配方固体ms粉末4.3g，nacl 1g，1％琼脂，去离子水定容至1l)，高温高压灭菌，灭菌温度为121℃，压力为1.05kg/cm2，灭菌时间为20min；
37.(3)2020年春，对步骤(2)收获的留作培养皿育秧的f1在泗阳育种基地于5月10日和其它多个品系按序号播种到培养皿内；
38.(4)对步骤(3)播种好的培养皿进行集中暗化处理，然后转移到光照培养箱内生长；
39.(5)待步骤(4)的秧苗达3叶期时及时用包含除草剂培养基培养，5-10 天；
40.(6)10天之后观察记载步骤(5)的效果。秧苗完全不受影响的标记“√”；秧苗部分受影响的标记
“”
；秧苗完全萎缩死亡的标记
“×”
号，其中步骤(2) 金粳818/泗稻2096的f1完全不受影响(因为f1除草剂抗性完全显性)，用“√”标记；
41.(7)对步骤(6)培养皿内的稻苗运至田间，种植编号为k72，栽植3行，每行10株，株距为15cm，行距为25.0cm，待水稻成熟时进行单株选择8个，收获f2，室内考种决选5株；
42.(8)2020年冬-2021年春，对步骤(7)决选的5个f2单株继续南繁加代，南繁编号2416-2420，分系混收f3；
43.(9)2021年春，对步骤(8)收获的5份f3重复进行步骤(3)、(4)、(5)、 (6)步骤，系号分别为k24-k28，5个系的秧苗都存在死苗现象，但存活下来的秧苗都很健壮，用“√”标记。
44.(10)对步骤(9)的秧苗重复步骤(7)，待水稻成熟时继续田间选择。
45.由图1可以看出，红圆框内的幼苗利用除草剂筛选后，不携带抗性靶标基因会自然死亡。
46.由图2可以看出，利用除草剂筛选后，携带抗性靶标基因的幼苗能正常生长。
47.由图3可以看出，利用除草剂筛选后，更换营养基质的幼苗继续生长。
48.本发明一方面快速准确鉴定水稻抗除草剂性能，加速抗除草剂水稻新品种选育进程；另一方面避免田间使用除草剂对水体和土壤的污染，避免其它不抗除草剂品种受到的影响，选育出的水稻品种可以很好地服务于直播、机插等轻简化栽培。
49.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：

1.一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法，其特征在于：包括以下步骤：1)育秧辅助材料准备选用水稻专用塑料软盘平铺在同规格的硬盘内；2)配置营养基质固体ms培养基(一种植物培养基)中加入1％琼脂，去离子水定容ms培养基至1l，高温高压灭菌；3)标记培养皿分批配置营养基质，一批在培养皿中加入20ml ms培养基，待其凝固，另外一批在培养皿内加入相应的咪唑啉酮类除草剂，用黑油墨笔在培养皿上标记水稻材料编号；4)育种材料播种将需要进行除草剂抗性鉴定的水稻育种材料按品系序号对应均匀播在不含除草剂的培养皿内，每皿种子播种量不超过5克，以利壮苗；5)培养皿封口将播种完成的培养皿用塑料薄膜封口，防止其他病菌落入培养皿，同时保温；6)适时更换培养基培养基支持水稻苗5-8天生成所需的营养，5-8天之后需要更换新的培养基，水稻幼苗发芽进入3叶期前转移至含有除草剂的培养基中；9)秧苗抗性记载在含有除草剂的培养基内生成5-6天，即可发现稻苗生长产生差异，10天进行秧苗除草剂抗性记载，秧苗完全不受影响的标记“√”；秧苗部分受影响的标记秧苗完全萎缩死亡的标记
“×”
号；10)抗性秧苗移栽将标记“√”与的培养基运到田间按品系序号单苗进行栽插，进行常规管理，每个品系记录生育期、株高、株型等基本农艺性状，成熟后进行单株田间选择，室内考种决选。2.如权利要求1所述一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法，其特征在于：所述步骤1)中水稻专用塑料软盘规格为28cm
×
58cm
×
3cm。3.如权利要求1所述一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法，其特征在于：所述步骤2)中固体ms培养基为ms粉末4.3g，nacl 1g。4.如权利要求1所述一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法，其特征在于：所述步骤2)中灭菌温度为121℃，压力为1.05kg/cm2，灭菌时间为20min。5.如权利要求1所述一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法，其特征在于：所述步骤10)中每个品系栽植3行，每行10株，株距为15cm，行距为25.0cm。

技术总结

本发明公开了一种利用培养皿育秧精准鉴定抗除草剂水稻育种方法，包括以下步骤：1)育秧辅助材料准备；2)配置营养基质；3)标记培养皿；4)育种材料播种；5)培养皿封口；6)适时更换培养基；9)秧苗抗性记载；10)抗性秧苗移栽。本发明的有益效果在于：一方面快速准确鉴定水稻抗除草剂性能，加速抗除草剂水稻新品种选育进程；另一方面避免田间使用除草剂对水体和土壤的污染，避免其它不抗除草剂品种受到的影响。避免其它不抗除草剂品种受到的影响。