DOI: 10.13419/j ki.aids.2021.04.05.论著.
2018年我国部分省份抗病毒前HIV-1整合酶
抑制剂耐药流行情况
宋畅，周佳佳，董敖渤，康瑞华，阮玉华，邵一鸣，冯毅，廖玲洁，邢辉
(中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心，北京102206)
摘要：目的了解我国2018年部分省份抗病毒前HIV感染者中整合酶抑制剂的耐药株流行情况：方法 在我国不同区域的6个省份，收集部分2018年抗病毒前H1V感染者血浆样本，提取病毒基因组核糖核酸，RT-PCR扩增整合酶基因片段并测序，利用进化树和HlVdh数据库，分别进行H1V亚型及耐药分析，并比较不同亚型 间整合酶抑制剂相关的耐药遗传屏障差异。结果共获得序列755条，其中流行重组亚型CRF07_BC占35.9%(271 例）、CRF01_AE 为 34.3%(259例）、CRF08_BC 占15.1%(114例）、CRF55_01B 占 2.8%(21 例）和、占1.7%(13 例），其他重组亚型占1〇.2%(77例）；整合酶抑制剂相关耐药突变的样本有6例，耐药率为0.8%(6例），其中1例对拉替拉韦 (RAL)高度耐药，其余5例均对艾维雷韦和RAL低度耐药。相比欧美B亚型标准株HXB2，我国CRF01_AE、CKF07_BC、CRF08_BC和CKF55_0丨B亚型共有24个固有突变位点；与欧美B亚型比较，CKR)7_BC在T66K位点上具 有较高耐药 遗传屏障，CKF01_AE、CRF08_BC和CRF55_01B在(;140S、G140C位点上具有较高的耐药遗传屏障。
结论我国2018年部分省份前人H1V-1整合酶抑制剂耐药毒株流行水平较低，主要流行重组亚型相比欧美B 亚型具有较高的耐药遗传屏障。
关键词：艾滋病病毒；整合酶；亚型；基因多态性；遗传屏障
中图分类号：K512.91; R 373.9 文献标志码：A文章编号：1672-5662(2021 )04-0348-04
A survey on integrase inhibitor related resistance in HIV-infected persons before antiretroviral treatment in China
in 2018 SONG Chang, ZHOU Jiajia, DONG Aobo, KANG Ruihua, RUAN Yuhua, SHAO Yiming , FENG Y i, LIAO Lingjie, XING Hui. (National Center for AIDS/STD Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)
Correspondingauthor:XINGHui,mastertutor,Email:******************
Supported by the National Science and Technology Major Project "Prevention and Treatment of Majo
r Infectious Diseases such as AIDS and Viral Hepatitis" (2017ZX10201101); the National Natural Science Foundation of China (81471962, 81261120393); the National Science and Technology Major Project (2018ZX10721102); Beijing Science and Technology Program (D161100000416002)
Abstract: Objective To investigate the prevalence of integrase inhibitor related resistance in HIV-infected persons before antiretroviral treatment (ART) in China in 2018. Methods HIV-infected patients were consecutively selected prior to ART in six provinces located in the southeast and northwestern China. Plasma samples were collected, on which HIV genomic RNA was extracted. A fragment of HIV integrase region was amplified by nested RT-PCR and sequenced. Based on the obtained sequences, HIV-1 subtypes were determined by phylogenetic analyses by using Fasttree2.0, and integrase inhibitor related resistance mutations were identified by using Stanford HlVdb. Genetic barriers for specific resistance mutations of major circulating recombinant forms were calculated and compared with B prevailing in the western countries. Results A total of 755 sequences were obtained, 35.9% (271) of which were CRF07 BC, followed by CRF01AE (34.3%, 259), CRF08_BC(15.1%,114), CRF55_01B (2.8%, 21), (1.7%, 13), and other strains (10.2%,77).
------------------------------ There were 6 cases of integrase inhibitor related
收稿日期：2020-06-13；修回日期：2020-07-27
基金项目：国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染 病防治”（2017ZX10201101)；国家自然科学基金（81471962, 81261120393)；国家科技重大专项（2018ZX10721102)；北京市科技 计划项目（丨)丨61100000416002)
第一作者简介：宋畅（1991一），男，北京市人，研究艾滋病耐药：Email: songchang_cdc.@qq.(.om
通信作者：邪辉，Email:******************resistance, with the resistance rate of 0.8% (6). One harbored resistance to RAL at high level, and other five were resistant to EVG and RAL at low levels. In contrast with HXB2, the reference strain of subtype B, totally 12 subtype-specific polymorphisms were found in CRF01AE, CRF07 BC, CRF08 BC and CRF55_ 0IB. As compared to subtype B strains, CRF07—BC
had a higher genetic barrier to produce T66K resistance mutation, and CRF01AE, CRF08 BC and CRF55 01B had higher genetic barriers to G140S and G140C mutations. Conclusion The prevalence of integrase inhibitor related resistance is relatively low among HIV/AIDS patients before ART. The major CRFs in China have higher genetic barriers to some resistance mutations in integrase domain.
Keywords: HIV; integrase; subtype; gene polymorphism; genetic barrier
整合酶抑制剂是一类新型的ART药物，可抑制 HIV-1整合酶链转移过程，阻止病毒DNA整合到宿 主染体DNA上。自2007年首次获得临床批准应 用以来，整合酶抑制剂在安全性和耐受性、对病毒快 速抑制和高效性等方面，均表现出明显的优势11，目目IJ已获批的药物有拉替拉韦（Raltegravir,RAL)、艾 维雷韦（Elvitegravir，EVG)、多替拉韦（Dolutegravir，DTG)和比昔格韦（Bictegravir，BIC)，而卡博格韦(Cabotegravir)目前处于临床评估阶段[2]。2018年 WHO推荐基于DTG的方案作为成人和儿童的首选 一线方案。本文对2018年我国6个省份5个区 域抗病毒前人中进行整合酶基因区(IN)耐药 突变特征和遗传屏障分析，为抗病毒方案的制 定提供参考。
1对象与方法
1.1对象6个省份5个区域[东北黑龙江省（低流 行地区）、华东浙江省和华中湖南省（中等流行地 区）、华南广西壮族自治区（简称广西）、西南四川省 和云南省(高流行地区):3i]的年龄>18岁、2018年1一 6月初始抗病毒前HIV感染者。
1.2方法在上述6个省份，各调查省需选择至少2 个抗病毒门诊点，按初始抗病毒时间先后 顺序人组；能够并愿意提供书面（或口头）知情同意 书。排除以前接受过抗病毒者。调查方法按 我国抗病毒耐药监测方案操作:4]。
核酸提取和扩增：使用生物梅里埃公司NucliSENSEasyMAG HIV-1 V2.0 试剂盒，提取病毒 RNA，RT-
PCR扩增IN区866 bp长度的目的基因片 段，并测序。
HIV亚型及耐药的判定米用Sequencher4.10.1软件对序列进行拼接和编辑，用BioEdit软件进行序 列比对、清理，使用Mega 6和Fast Trees软件构建进 化树，判定亚型；通过美国斯坦福大学HIV耐药数据 库（hivdb.stanfor(l.edu/8.6.1)判别是否存在耐 药突变，并评估耐药程度。
耐药遗传屏障是指病毒对特定的药物产生耐药 所需要突变的碱基个数5，其中嘌呤与嘌呤之间的 替换，如A< = > G，或嘧啶与嘧啶之间的替换，如T < =>C，称为基因转换；而嘌呤与嘧啶之间的替换，如 A< = > T、A< = > C、G< = > C，或G< = >T，贝I J称为 基因颠换；通常情况下，基因转换发生的概率约是基 因颠换的2.5倍[6_7:，所以在耐药遗传屏障计算时，将 转换赋值为1，颠换赋值为2.5；参照野生型密码子，选择最接近的耐药突变密码子，计算转换和颠换的 数量，赋值总和为耐药遗传屏障值:8]。
1.3统计分析采用SPSS20.0进行统计学分析，以亚型为分组变量，耐药遗传屏障赋值为检验变量，采 用非参数Kmskd-Wallis方法检验不同亚型间遗传 屏障的差异为P< 0.05定义为有统计学意义，两两比 较采用Mann-Whitney U检验，P< 0.01为差异有统计 学意义。
2结果
2.1 ART前HIV感染者一般情况6个省共纳人755例HIV感染者，感染者中男性占79.2%(598例），女性占20.8%例（157例），年龄（中位数）35，30〜40岁占40.1%例（303例），汉族占78.5%(59
3.例），已婚占 4
4.9%(339例），文肓占
5.7% (43例），同性性行为和 异性性行为感染分别占42.1%(318例）和52.3%( 395 例）,ART前HI V感染者一般情况见表1。
表1我国2018年6个省份ART前HIV感染者一般情况
变量人数构成比/%感染途径异性性行为39552.3
同性性行为31842.1
注射24 3.2
其他18 2.4省份广西14919.7
黑龙江15019.9
浙江12716.8
云南13918.4
四川9612.7
湖南9412.5
2.2亚型及耐药样本特征755例HIV感染者耐药率为0.8%(6例），主要的毒株亚型为CRF07_BC占35.9% (271 例）、CRF01_AE占 34.3% (259 例）、CRF08_BC 占 15.1%(114 例）和 CRF55—01B 占 2.8% (21例），B'<:N占1.7%(13例）。其他重组亚型占
10.2%(77例）。CRF07_BC亚型有4例耐药毒株，均 药，耐药突变位点为E138A;C R FX)8_BC亚型有1例 为针对EVG、RAL的低度耐药，其中3例均在138位 耐药株，对RAL高度耐药，耐药突变位点为Y143C。点，1例含E157Q和G163MRV两个次要耐药突变位 详见表2。
点；丨例为B'e N l型毒株，针对EVG、RAL的低度耐
表2抗病毒前H1V感染者整合酶抑制剂耐药突变位点及耐药
样本编号地区感染途径亚型性别年龄婚姻状况耐药突变位点耐药药物GX17S0297广西同性性行为CRF07_BC男41已婚E138K L：EVG,RAL HL18S107黑龙江省同性性行为b，c n男33未婚E138A L：EVG,RAL LS18S0156四川省不详CRF07_BC女59未婚E138K L：EVG,RAL WZ20180028浙江省异性性行为CRF08.BC女39已婚Y143C H：RAL YN18SDL058云南省异性性行为CRF07_BC男32已婚E157Q,G163MRV L：EVG,RAL YN18SDL214云南省异性性行为CRF07_BC女40已婚E138A L：EVG,RAL 注：低度耐药（low-level resistance, L)、高度耐药（high-level resistance, H):
2.3整合酶区多态性位点与欧美B亚型标准株 HXB2的氨基酸序列比较，发现CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC 和 CRF55_01B 亚型分另丨J有 66、42、37和15个多态性位点，其中共有24个位点的 氨基酸替换率大于50%，可称为亚型固有位点（表3)，亚型特有位点包括CRF0L A E的V72I、K136R, CRF07_BC 的K136Q、L234S，CRF08_BC 的 K211R、T218I,CRF55_01B的 E11D、A21T和 D41 N，所有亚 型均有T124A和T125A位点。
病毒样本2.4耐药遗传屏障分析对整合酶区所有耐药位 点进行遗传屏障的分析，从HIV databases序列数据 库（https:"www.v/components/sequence/ HIV/search/search.html)中下载 141 条 2018 年美国未 人欧美B亚型区序列，和我国主要流行的 4种流行重组亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和CRF55_01B—起进行比较。共发现3 个耐药突变位点的遗传屏障存在统计学差异，分别 是 T66K(P<0.001)、G140S(P<0.001)、G140C (P< 0.001)，详见表4。然后分别与欧美B亚型两两比
较，结果我国CRF07_BC亚型较难发生T66K耐药突 变，CRF01—AE、CRF07—BC、CRF08—BC、CRF55—01B 亚型较难发生G140S和G140C突变，Mann-Whitney U检验，P均 <0.001。
3 讨论
本研究显示，我国6个省份2018年前人 中整合酶抑制剂耐药株的流行水平较低，这与最近 在我国未感染者中的调查结果基本一致91，也 与我国尚未常规使用整合酶抑制剂的情况相符。在 南非的调查中整合酶抑制剂主要耐药突变很少[9:，在欧美一些发达国家的应用已经比较普遍，但整合
表3多态性突变位点占比/%
亚型
CRF01_AE
U=259)
CRF07_BC
(n=266)
CRF08_BC
(n=112)
CRF55_01B
(n=2\) E11D27.00.00.071.4
K14R71.00.00.071.4
A21T44.40.00.076.2
V31I66.466.270.50.0
D41 N 1.90.00.052.4
K42Q0.088.066.10.0
V72I57.90.00.00.0
I84M0.069.962.50.0
L101I0.097.798.295.2
T112V96.938.792.00.0
T124A84.682.769.676.2
T125A98.194.078.695.2
G134N98.80.00.076.2
1135 V90.00.00.085.7
K136Q0.067.70.00.0
K136R69.90.00.00.0
D167E72.60.00.095.2
V201I100.097.40.0100.0
K211R0.00.094.60.0
T218I0.00.069.60.0
L234I95.40.097.3100.0
L234S0.058.30.00.0
R269K0.077.867.90.0
D278A0.094.092.90.0
酶耐药的病例很少报道，在欧美地区未的HIV- 1人中的调查也显示未发现整合酶相关主要耐药 突变;1°_12]。本调查中发现的主要耐药位点有E138A/ K、Y143C，还有1例含次要耐药突变位点E157Q和G163MRV〇E138K/A突变与 RAL、EVG和 DTG等药 物的相关，可引起对RAL、EVG的低度耐药，当
表4耐药位点遗传屏障
氨基酸位置野生型密码子
突变株
欧美B
U=141)
CRF01 一A E
U=246)
CRF07_BC
(n=256)
CRF08—BC
U=104)
CRF-5501B
U=21)
耐药突变的
密码子
突变方式/赋值p值
T66K ACA/ACG14124413710321AAA/AAG1TV/2.5<0.001 ACC/ACT0211910AAA/AAG2TV/5
G140S GGC/GGT1391010AGC/AGT1TS/1<0.001 GGA/GGG224525610321AGT/AGC lTS,lTV/3.5
G140C GGC/GGT1391010TGC/TGT1TV/2.5<0.001 GGA/GGG224525610321TGT/TGC2TV/5
注：TS为转换;T V为颠换。P值为不同亚型间多组比较的ICmskal-Wallis检验结果
与Q148突变一起发生时，会产生RAL和EVG的高 度耐药和对DTG和BIC的中度耐药:|3]，但本次并未 发现与Q148联合突变。Y143C可导致对RAL高度 耐药，但不会降低DTG或BIC敏感性。上述耐药株 分布于调查的各个省份，虽然我国整合酶抑制剂的 使用还处于起步阶段，但所调查的省份均发现存在 针对一代整合酶抑制剂RAL和EVG的耐药株，需要 密切监测其耐药的发生和发展。
不同亚型间的区别可表现为多态性突变位点的 差异，本调查中可以看到在V31I、L101I、T112V、T124A、T125A、V201I、L234I等7个多态性位点的突 变频率较高。CRF01_AE亚型的固有突变有V72I、K136R，与最近其他调查结果基本一致u4_l5]，而我国 新流行的CRF55JM B亚型中有12个固有
突变，在整 合酶区存在的多态性突变位点，是否会影响整合酶 的耐药突变和耐药水平，值得进一步研究。
亚型间也存在整合酶抑制剂耐药的遗传屏障差 异，主要有T66K、G140S、G140C突变位点。T66K突 变与EVG的选择相关，可引起EVG高度耐药，RAL 中度耐药和DTG低度耐药。G140S突变通常与Q148H—起发生引起HIV-1对RAL和EVG药物 敏感性降低100倍以上，降低DTG敏感性10倍，单独 出现影响最小，而140C与140S有相似作用:13]。
综上，本次调查发现我国前人中整合酶 抑制剂耐药株流行水平较低，且主要针对一代整合 酶药物耐药，密切关注整合酶抑制剂在我国的使用 及相关耐药株的流行情况，可为我国艾滋病抗病毒 的可持续发展提供科学数据。
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