【摘要】：目的 对新冠病毒核酸检测方法与各环节要点展开分析探讨。方法 选取2019年12月~2020年3月我院发热门诊收治的7例新冠病毒疑似病例作为研究对象，均采用核酸检测方法进行临床检验。结果 取咽拭子样本及深部痰样本的病毒核酸检出率之间有明显差异，咽拭子样品中新冠病毒阳性检出率低于深部咳痰；普通棉签拭子的核酸检出率明显低于带病毒保存液的植绒拭子(P<0.05)。结论 核酸检测对新冠病毒临床检验具有重要意义，各临床实验室应在现有研究报道及文件和指南的基础上，根据自身条件对新冠病毒核酸检测全过程进行严格的质量控制及合理的优化。 【关键词】：新型冠状病毒；新型冠状病毒肺炎；核酸检测；诊断
Novel coronavirus nucleic acid detection method and the key points of each link
【 abstract 】 : objective to analyze and discuss the nucleic acid detection method of novel coronavirus and the key points of each link.Methods 7 suspected cases of novel coronavirus admitted to the fever clinic of our hospital from December 2019 to March 2020
were selected as the study subjects.Results the detection rate of virus nucleic acid in swab samples and deep sputum samples was significantly different. The positive detection rate of novel coronavirus in swab samples was lower than that in deep sputum samples.The nucleic acid detection rate of ordinary cotton swab was significantly lower than that of flocking swab with virus preservation solution (P<0.05).Conclusion nucleic acid testing is of great significance for clinical testing of novel coronavirus. Based on the existing research reports, documents and guidelines, each clinical laboratory should conduct strict quality control and reasonable optimization of the whole process of nucleic acid testing of novel coronavirus according to its own conditions.
【 key words 】 : novel coronavirusCOVID - 19;Nucleic acid testing;diagnosis
2019年12月以来，新型冠状病毒感染引起的肺炎病理数快速攀升。因患者体内病毒核酸的存在是目前唯一的确诊依据，而目前临床上普遍反应核酸检测阳性率不满意，故对病毒核酸检测的实验室条件、检验人员要求及检测过程中各个环节都有较高要求。本文着重阐述新型冠状病毒核酸检测各个环节中的检测要点、最新的行业规及共识内容，同时探讨临床
检测中的疑难问题，以期为新型冠状病毒所致疾病的准确诊断提供理论依据。本文将围绕目前新冠病毒核酸检测中的关键环节及其中可能影响核酸检测结果及时性、准确性的因素进行评述。
1 资料与方法
1.1一般资料
选取我院2019年12月~2020年3发热门诊收治的7例新冠病毒疑似病例为研究对象，其中男3例，女4例，年龄22~65岁。入院的7例新冠病毒疑似病理均进行核酸检测。
1.2临床表现
潜伏期3~7d，多数不超过14d，但目前发现最长可达24天或许更长。以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴有闭塞、流涕、腹泻等症状。重型病理躲在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。
1.3新冠病毒核酸检测方法
采用RT-PCR检测技术。根据国家卫生健康委员会发布的新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南，在实验室要确认一个病例为阳性，需满足同一份标准中新冠病毒的ORF1ab及N基因2个靶标特异性RT-PCR检测结果均为阳性，或单靶标阳性患者重新采样/另一类型样品检测仍为单靶标阳性，故实验室针对新冠病毒的核酸检测应至少包含最为保守及特异的ORF1ab区域以及N基因。
2.新冠病毒核酸检测实验室生物安全要求
2.1实验室及检验人员生物安全
自新冠肺炎疫情爆发以来，各医院检验科面对新冠病毒检测量增加、确诊/疑似病例和普通患者的标本不易区分、实验室空间限制、生物安全防护物资不足等各类问题，临床实验室特别是进行新冠病毒核算检验的科室的生物安全防护措施尤为关键。目前国家卫生健康委员会对新冠病毒暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理，根据最新版的新冠病毒实验室检测指南及实验室生物安全指南，如无法对原始样本进行可靠的灭活，则对其进行的核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护(建议至少穿戴工作服、一次新工作帽、双层手套、医用一次性防护服、医用
防护口罩或动力送风过滤式呼吸器、防护面屏或护目镜、工作鞋或胶鞋、防水靴套)，各实验室还可根据自身情况增加进一步的防护；同时标准预防、不定期通风和手卫生等重要的防护措施必不可少。
2.2原始样本的灭活及对核酸检测的影响
新冠病毒实验室检测指南中未对原始样本的有效灭活条件进行规定或建议，在目前最新的新冠病毒核酸检测专家共识中，建议采用56℃水浴45min，并可根据提取试剂在标本裂解时所采用的温度调整灭活温度，但不低于56℃，此条件是依据以往对MERS等病毒灭活条件的研究。同时专家共识也建议各实验室对原始样品的灭活条件有预实验结果的支持。由于目前常见样本类型的新冠病毒核酸阳性检出率仍不高，故任何可能降低病毒核酸提取效果及检出率的因素，如样本灭活条件及灭活时间等均应引起重视。此前，华中科技大学附属同济医院检验科的专家学者对PCR检测病毒核酸(以乙型流感病毒为例)进行了相应的小样本量比对，结果发现未灭活处理、56℃水浴30min，及50℃干预1h的同一样本其PCR检测阳性结果的扩增曲线CT值无明显变化，可作为新冠病毒样本灭活的参考。根据笔者所在研究团队20例新冠病毒感染者的同一样行样本分别进行56℃干浴30min及65℃干浴30min后，其PCR检测的阳性CT值无明显差异(P>0.05)，该研究结果尚未发表。
3结果
3.1不同样品类型中新冠病毒的核酸检测
在临床上的新冠病毒疑似病例分别采集不同类型呼吸道样品进行核酸检测，结果初步提示在新冠病毒感染中，取咽拭子样本及深部痰样本的病毒核酸检出率之间有明显差异，咽拭子样品中新冠病毒阳性检出率低于深部咳痰。
3.2不同呼吸道样本取样材料对新冠病毒核酸检测结果的影响
在确诊患者中对比了带病毒保存液的植绒拭子样本及无病毒保存液的普通棉签拭子样本的新冠病毒核酸检测结果，发现普通棉签拭子的核酸检出率明显低于带病毒保存液的植绒拭子(P<0.05)。
4 讨论
根据目前最新版新冠病毒诊疗指南、防控方案及实验室检测专家共识，对新冠病毒的核酸检测均应至少检测ORF1ab及N基因(或E基因)，检测的通道同时阳性时判定为阳性，并均
踢打阴性结果不能排除新冠病毒感染，应考虑各环节中导致假阴性的原因。同时在第五版实验室检测技术指南中，对于单通道阳性结果，不仅要求重新采样及检测，对结果判定也增加了新的要求，即重新检测结果仍为单通道阳性时，判定heUS那检测结果为阳性；同时增加了2种类型样本均检测得到单靶标阳性结果时，应判定核酸检测结果为阳性。
病毒样本综上所述，各临床实验室应在现有研究报道及文件和指南的基础上，根据自身条件对新冠病毒核酸检测全过程进行严格的质量控制及合理的优化。
参考文献
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