KZNF论文：KZNF 真核表达 P53 转录 选择性调控 【中文摘要】第一部分KzNF家族《ABxz型)真核表达载体pCMVMyc—KzNFs的构建与P53的转录因子活性调节子的筛选构建KzNF家族（ABXZ型）真核表达载体pCMVMyc—KzNFs，用于筛选KzNF家族中P53调控分子。筛选对于P53转录因子活性有影响的真核表达载体pCMVMyc—KzNFspgl3，用于深入筛选。方法利用试剂盒从多种细胞中提取RNA，并逆转录得到cDNA，利用合成的引物，用PCR的方法合成DNA片段，酶切后连入经过相同酶切的pCMV—Myc载体，测序正确，通过转染并裂解煮沸真核细胞，利用westem B10t检测方法验证质粒表达情况。将pCMV—Myc—KzNFs，RL：CMV，pGl3L质粒转染至结肠癌细胞HCTll6P53+/+和HCTll6 P53。（同时转入外源P53质粒，即pCMVF1ag—P53质粒）中，转染48h后用于报告基因实验，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光参数的比值，确定P53的转录因子活性在KzNFs过量表达时是否发生显著改变。结果成功构建KzNF家族（ABXZ型）中大部分真核表达载体pCMVMyc—KzNFs（25／28）真核表达载体。结肠癌细胞HCTll6 P53一，HCTll6 P53。中，部分外源KzNF蛋白的过量表达，使内源或外源P53转录因子活性发生显著降低，在极小部分KzNF蛋白表达的情况下，内源或外源P53转录因子活性受到明显激活，另外一部分KzNFs的蛋白表达对于内源或外源P53的转 录因子活性没有显著影响。结论真核细胞中外源KzNF蛋白过量表达的情况下，一部分KzNF家族成员，很可能对于癌细胞中表达的P53的转录活性具有强烈抑制或者激活作用，另一部分则对于P53转录因子活性没有明显的影响。所以不同的KzNF家族成员在P53调控功能上具有差异性。筛选出的对于P53的转录因子活性有显著影响的KZNF分子可以用于进行下一步的筛选工作。第二部分筛选与P53有直接结合能力的KZNF家族成员（ABxZ型），明确KZNFs对内外源P53功能选择性调控筛选与P53有直接结合能力的KZNF家族成员（KRAB AB×z型），明确：KZNFs对内外源P53功能调控的选择性。方法利用免疫共沉淀实验验证细胞内转染pcMVFlag-P53和上一步筛选到的部分外源pCMVMyc-KZNFs的体内结合能力，筛选出的有能力结合P53的pCMVMyc-KZNFs，用于梯度转染人类结肠癌细胞HCTll6 P53一，HCTll6 P53。中，在过量表达外源KZNF蛋白的情况下，蛋白质免疫印迹的方法检测P53下游各个靶基因蛋白表达是否受到梯度性的抑制。结果HCTll6 P53。中，外源P53和部分外源KZNF成员存在很强结合能力，另外一部分KZNF蛋白分子与P53蛋白未检测到蛋白质两两相互作用。HCTll6 P53”，HCTll6 P53。中内源或外源P53存在下，P53的下游某个或某些特定靶基因的蛋白表达受到了某些KZNF家族成员的特异性抑制。结论HCTll6 P53一，HCTll6 P53。细胞内的KZNF家族一部分特定成员很可能与P53在结构上
存在直接相互作用，并且在这部分可以结合的成员中有一部分成员可以明显选择性抑制P53的凋亡、代谢等功能，很可能属于apak的亚家族成员。我们挑选对于P53转录活性具有抑制作用的KZNF蛋白用于进一步筛选和功能研究。
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