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双荧光素酶报告基因检测系统-promega

Dual-Luciferase® Reporter Assay

试剂准备

Luciferase Assay Buffer II 10ml

Luciferase Assay Substrate 1vial

Stop & Glo® Buffer 10ml

Stop & Glo® Substrate, 50X 200ul

Passive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml

1. 1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH20中，40C保存（一个月）。

2. LAR II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay Buffer II 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。

3. 1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo® Substrate加入49体积的Stop & Glo® Buffer中（-200C保存15天）。（每次试验需要100ul）

细胞处理

1. 吸除细胞培养液

2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞

3. 加入1X PLB（推荐用量）

4. pgl3细胞溶解

室温条件下，轻摇细胞15min，

瞬时转染和报告基因实验

采用脂质体介导技术转染。重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。

1. 将质粒DNA(3.2µg)与phRL-tk (0.8µg)按1:4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;

2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min;

3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0.8mL;

4. 6h后，加入2mL完全DMEM;

5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;

6. 100µg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 µM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)；

（H2O2不引起OGG1升高）

7. 采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为化学发光仪(30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作。

8. 以相对荧光素酶单位(相当于对照组的百分比)表示。结果采用Student-t检验分析各组之间荧光素酶活性的差异。

本文发布于:2024-09-21 19:47:45，感谢您对本站的认可！

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标签：检测细胞转染培养液荧光素酶活性采用

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