王静云;窦柏蕊;包永明;李森武
【摘 要】通过琥珀酸酐将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI,分子量1000)偶联到普鲁兰多糖(Pullulan)上,合成了新型基因载体P-PEI.利用1H NMR、FTIR、粒度仪、Zeta电位仪、透射电镜和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝胶阻滞实验结果证明,载体P-PEI在体外可以通过静电相互作用稳定结合pDNA,并能有效抑制DNA水解酶及血清成分对pDNA的降解.噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、绿荧光蛋白表达质粒(pGFP)及荧光素酶表达质粒(pGL3)转染实验结果表明,载体P-PEI在N/P高达12.5时对细胞MCF-7,HeLa和COS-7的毒性低于PEI；当N/P为6.25时能有效将pGFP和pGL3带入Hela细胞并表达,最佳转染效率及荧光素酶活分别为[(36.67±0.25)％和(28.73±7.19)×108 RLU/mg蛋白,RLU为光强度],比Lipo 2000[(49.13±0.61)％,(58.47±7.62)×108 RLU/mg蛋白)略低.因此以Pullulan为骨架材料的P-PEI是一种新的有潜在应用价值的非病毒基因载体.%A novel non-virus gene delivery vector (P-PEI) was synthesized by grafting low-molecular branched PEI(molecular weight; 1000) onto the backbone of pullulan with succinic acid as a spacer. 1H NMR, FTIR, particle size analysis and zeta-potential measurements, TEM and gel electrophoresis were performed to characterize P-PEI and P-PEI/pDNA complexes. Gel electrophoresis retardation assay demonstrated that P-PEI can wrap pDNA with electrostatic interaction excellently even in the presence of heparin, and protect pDNA from the degradation by DNase I and serum. Compared with PEI/pDNA complexes, the P-PEI/pDNA complexes show relative lower cytotoxicity against MCF-7, HeLa and COS-7 cells, even at high N/P(up to 12. 5) demonstrated by MTT assay. Flowcytometry revealed that the highest transfection efficiency[ (36. 67±0. 25)% ] for P-PEI as a delivery agent was obtained at N/P ratio of 6. 25, which was comparable with that of Lipo-fectamine 2000[ (49. 13 + 0. 61 )% ] , and consistent with the results of luciferase expression. These results suggest that the pullulan-grafted branched polyethylenimine polymer (P-PEI) might be an excellent biocompat-ible candidate for gene delivery systems.
【期刊名称】《高等学校化学学报》
【年(卷),期】2012(033)008
【总页数】8页(P1757-1764)
【关键词】普鲁兰多糖;聚乙烯亚胺;绿荧光蛋白表达质粒pGFP;非病毒基因载体
【作 者】王静云;窦柏蕊;包永明;李森武
【作者单位】大连理工大学生命科学与技术学院,大连116024;大连理工大学生命科学与技术学院,大连116024;大连理工大学生命科学与技术学院,大连116024;大连理工大学生命科学与技术学院,大连116024
【正文语种】中 文
【中图分类】O631.3;Q782
基因是指以一定方式将有作用的基因导入人体靶细胞纠正人自身基因结构或功能错乱，从而达到疾病的目的.目前，基因已从遗传病扩展到肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病及传染病等各个领域［1］.基因的成功与否很大程度上取决于是否有安全、高效的基因载体系统.目前基因载体主要有病毒基因载体和非病毒基因载体两类.病毒基
因载体虽然转染效率高，但是容易引起免疫反应，易于与野生型病毒重组，结合的DNA/RNA大小受限，生产成本高且易被污染，因此病毒载体的应用有限［2］.近年来，人们将重点转向非病毒基因载体的研究.人工合成的阳离子聚合物由于无免疫原性、结构和尺寸设计多样化而被广泛用于基因载体的研究［3，4］.其中聚乙烯亚胺(PEI)由于具有较高的转染效率而备受关注［5，6］.
富含氨基的PEI具有“质子海绵效应”，可与DNA链上负电性的磷酸根通过静电作用缔合形成复合物，将复合的DNA运送到细胞核内，实现高效的基因转染［6］.但PEI在生理条件下不能降解，其基因转染效率及细胞毒性与分子量大小相关，具有较高转染效率的大分子量PEI细胞毒性较大，而细胞毒性小的低分子量PEI几乎没有携带DNA的能力［7，8］.用生物相容性分子修饰高分子量PEI或将多个低分子量的枝化PEI接枝到生物可降解大分子骨架上是提高低分子量PEI的转染效率及降低PEI细胞毒性的有效方法［9～12］.以安全、无毒、亲水、生物可降解、自然界存在广泛的天然多糖作为基本骨架，成为人们研究的热点［13～15］.Thakor等［16］利用带正电荷的精胺修饰普鲁兰多糖制备了能高效转染肝细胞的基因载体，该载体低毒、生物相容性好;Rekha等［17，18］分别将环氧三甲基氯化铵及高分子量PEI(25000)接到普鲁兰多糖上制备转染效率高的基因载体.本研究旨在将低分子量枝化PE
I(1000)偶联到普鲁兰多糖上制备新的基因载体，研究新载体结合DNA及保护DNA的能力，同时评价其细胞毒性和作为基因载体对Hela细胞的转染效率.
1.1 试剂与仪器
普鲁兰多糖(Pullulan，分子量为100000，山东中清生物科技有限公司);琥珀酸酐(国药集团化学试剂有限公司);高分支度聚乙烯亚胺(PEI，Mw=1000，武汉强龙化工新材料有限责任公司);1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐［EDC·HCl，吉尔生化(上海)有限公司］;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，上海蓝源生物科技有限公司);4-二甲氨基吡啶(DMAP，阿拉丁产品);MCF-7，HeLa和COS 7细胞系购自中国科学院上海细胞研究所细胞库;DMEM细胞培养基(Gibco产品);胎牛血清(FBS，天津灏海生物制品科技有限责任公司);噻唑蓝(MTT，Amresco产品);Lipofectmine 2000(Invitrogen产品);绿荧光蛋白原核表达质粒(pGFP);萤光素酶原核表达质粒(pGL3);无内毒素小量质粒提取试剂盒Ⅰ(Omega公司产品);闪亮裂解缓冲液和ONE-GloTM明亮萤光素酶检测系统(Promega公司产品);改良型BCA蛋白质定量检测试剂盒［生工生物工程(上海)有限公司］;其它试剂均为分析纯.pgl3
核磁共振波谱仪(Varian INOVA 400);红外光谱仪(Nicolet公司200 SXV-1);透射电镜［FEL公
司TECNAI Spirit(120 kV)］;纳米粒度及电位分析仪(Malvern公司Zetasizer Nano ZS90);凝胶电泳仪(DYY-8C，北京市六一仪器厂);凝胶成像分析仪(Gene Company Limited，G:BOX);荧光显微镜(Olympus公司，U-RFL-T);酶标仪(Thermo Tisher Scientific);流式细胞分析仪(BD，FACSCanto);超灵敏微孔板式生物化学发光仪(Berthold公司LB960).
1.2 载体P-PEI的合成及表征
载体P-PEI参考文献［19，20］方法合成.在100 mL圆底烧瓶中，将Pullulan(1.64 g，0.01 mol糖单元)溶于 DMSO(30 mL)中，加入琥珀酸酐(1.0 g，0.01 mol)和DMAP(0.2 g，1.64×10－3mol)，于50℃搅拌18 h.加入无水乙醇(250 mL)剧烈搅拌30 min，过滤除去乙醇，将得到的反应物溶于少量的双蒸水中，透析纯化72 h.透析后的溶液冷冻干燥，得到P-COOH白固体，琥珀酰化程度用标准NaOH溶液滴定定量，用酚酞作指示剂.
将 P-COOH(250 mg，n—COOH=6.88×10－4mol)溶于30 mL PBS(0.2 mol/L，pH=7.8)中，加入 EDC(197.7 mg，1.03×10－3mol)和 NHS(118.7 mg，1.03×10－3mol)，4 ℃活化4 h.缓慢加入 PEI(121 mg，n—NH2=6.88×10－4mol)，室温下搅拌24 h.将反应产物透析纯化72 h.透析后的溶液冷冻干燥，得到PPEI白固体.反应过程如Scheme 1所示.
利用傅里叶变换红外光谱(FTIR，KBr压片)和核磁共振氢谱(1H NMR，D2O为溶剂，TMS为内标)对合成的载体P-PEI进行表征.
1.3 P-PEI/pDNA复合物的制备及理化性质表征
按照不同N/P(N/P为载体P-PEI与pDNA的质量比)将载体P-PEI与pDNA混合，涡旋混匀，25℃孵育40 min，备用.
取少量P-PEI溶液(0.05 mg/mL)滴在电镜观测所需的铜网上，待溶液晾干后用2%磷钨酸染2 min，待溶液再次晾干后，用TECNAI Spirit(120 kV)透射电镜观测.制备N/P分别为12.5，6.25，3.125，1.56，0的P-PEI/pDNA复合物(含20 μg pDNA，1.5 mL)，用于分析样品的粒径及Zeta电位.
1.4 P-PEI与pDNA的结合及肝素竞争实验
将N/P 分别为12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.156的 P-PEI/pDNA 复合物(含1 μg pDNA)进行琼脂糖凝胶电泳分析;另外将N/P为6.25的P-PEI/pDNA复合物(含1 μg pDNA)加入不同浓度肝素钠溶液(终浓度0，1，5，20，80 mg/mL)，在37℃水浴2 h，进行琼脂糖凝
胶电泳分析.电泳条件:1.0%琼脂糖凝胶(含0.2 μg/mL溴化乙锭作为染剂)，1×TAE为电泳缓冲液，电压140 V，电泳时间40 min.电泳结束后于凝胶成像系统中观察并拍照.
1.5 P-PEI/pDNA复合物的DNase I消化保护及血清保护实验
取N/P分别为1.56，3.125和6.25的P-PEI/pDNA复合物(含1 μg pDNA)2份，一份加入1 U DNase I，在37℃恒温水浴，按实验设定时间取经DNase I消化后的样品，加入EDTA(5 mmol/L)，在65℃恒温水浴10 min，加入适当浓度的肝素钠溶液(终浓度5 mg/mL)，在37℃恒温水浴2 h，进行琼脂糖凝胶电泳分析;另一份加入体积分数为50%的胎牛血清(FBS)，在37℃恒温水浴，按实验设定时间取样，加入适当浓度的肝素钠溶液(终浓度5 mg/mL)，在37℃恒温水浴2 h，进行琼脂糖凝胶电泳分析.
1.6 细胞毒性实验
MTT法检测载体P-PEI和P-PEI/pDNA复合物的细胞毒性.HeLa细胞以1×105cell/mL的浓度接种于96孔板上，每孔100 μL，于37℃，5%(体积分数，全文同)CO2条件下培养24 h.加入梯度浓度的P-PEI和P-PEI/pDNA复合物于培养基中(P-PEI/pDNA组按照不同的N/P加入，
每孔DNA含量相同;P-PEI组按照与P-PEI/pDNA组等量的聚合物进行实验)，每个浓度设6个复孔，分别设正常对照和空白对照(正常对照为不加药物组，空白对照为与实验孔平行的除不含细胞外其它条件相同的对照孔)，培养后检测细胞的存活率，支化PEI作为阳性对照.检测时弃掉细胞的培养液，每孔加入100 μL MTT溶液(终浓度为0.5 mg/mL)于5%CO2，37℃条件下培养4 h.小心吸去培养液并加入DMSO(100 μL/孔)溶解蓝紫结晶物，稍微振荡，待结晶物充分溶解后用酶标仪测定570 nm的OD值，参考波长为630 nm，细胞存活率的计算: 细胞存活率(%)= ［(OD损伤孔－OD损伤孔空白)/(OD对照孔－OD对照孔空白)］×100%.
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