糖皮质激素诱导A549细胞11β-羟基类固醇脱氢酶1型选择性启动子的使用 韩岩岩
【摘 要】目的 探讨糖皮质激素诱导11β-羟基类固醇脱氢酶1型表达,其选择性启动子的使用情况,为进一步研究糖皮质激素诱导的HSD11B1表达情况和基因的转录调控模式奠定基础.方法 糖皮质激素皮质醇(100 nM)和地塞米松(100 nM)预先处理A549细胞,通过半定量-RT-PCR和荧光报告基因检测方法,检测A549细胞中HSD11B1 mRNA表达水平和报告基因蛋白表达水平.结果 半定量-RT-PCR结果显示A549细胞中HSD11B1mRNA表达显著增加经由P1和P2两个启动子,但HSD11B1 mRNA表达主要来自于P2;荧光报告基因表达结果显示A549细胞中糖皮质激素诱导的P2荧光报告载体相对荧光活性显著增加,然而P1荧光报告载体相对荧光活性没有明显变化.结论 糖皮质激素诱导A549细胞HSD11B1表达经由选择性启动子P2. 【期刊名称】《遵义医学院学报》
【年(卷),期】2013(036)006
【总页数】4页(P507-510)
【关键词】糖皮质激素;11β-羟基类固醇脱氢酶1型;选择性启动子
【作 者】韩岩岩
【作者单位】遵义医学院公共卫生学院,贵州遵义563099
【正文语种】中 文
【中图分类】Q344.15
11β－羟基类固醇脱氢酶1型(11β－HSD1，基因名字HSD11B1)为糖皮质激素的代谢酶，它催化糖皮质激素C11位的酮基与羟基之间的氧化还原反应，使无活性的17羟11脱氢皮质酮(可的松)转化为有生物活性的皮质醇(人类)，主要作用是调节局部组织糖皮质激素的浓度［1］。在啮齿类，它催化皮质酮与脱氢皮质酮之间的转化［2］。11β－HSD1的表达和活性改变可导致糖皮质激素代谢紊乱，易引发肥胖症、2型糖尿病、高血压等代谢综合征［3－5］。直到最近人们才发现，11β － HSD1基因的表达调控是由选择性启动子控制的［6］，分别是位于远端的启动子1(Promoter 1，P1)和位于近端的启动子2(Promoter 2，P2)。目前关于11β－HSD1选择性启动子的研究不是很多。糖皮质激素是已知HSD11B1的
调节子，可以诱导HSD11B1的表达。本文主要是探讨糖皮质激素(GC)诱导HSD11B1表达其选择性启动子的使用情况，为进一步研究GC诱导的HSD11B1表达情况和基因的转录调控模式奠定基础。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 A549细胞(肺腺癌细胞系)培养在37℃5%二氧化碳90%湿度环境中，用DMEM培养液，添加10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(0.1 mg/mL)和谷氨酰胺(2 mM)，所有培养细胞的产品来自PAA实验室(Coelbe，德国)。
1.2 提取基因组DNA 用机械法收集单层A549细胞，然后加入1 mL细胞裂解液。基因组DNA的提取采用酚/氯仿法:悬浮液中加入1 mL的苯酚旋涡搅拌1 min。将悬浮液在室温下孵育5 min，然后13 000 r/min离心5 min。上相液体被转移到一个新的离心管，加氯仿1 mL旋涡搅拌1 min，混合物再以1 3000 r/min离心1 min(两次)。上相液体被转移到一个新的离心管，加入两个体积的100%乙醇，然后在13 000 r/min离心10 min。片状DNA颗粒用2 mL 70%乙醇洗涤，然后以13 000 r/min离心5 min。最后，DNA颗粒在室温下干燥5 min，溶于500 μL TE缓冲液。
1.3 荧光报告载体的构建 克隆11β－HSD1远端启动子 1(P1，2.173 kb)和近端启动子(P2，2.506 kb)，用A549细胞基因组DNA为模板，引物(见表1)。将PCR产物克隆入pCR2.1－TOPO载体的多克隆位点，通过测序鉴定插入片段。然后将P1和P2片段再次克隆到pGL3荧光报告载体，获得目的荧光报告载体pGL3－P1和pGL3－P2。
1.4 半定量RT－PCR A549细胞用6孔板培养，传代1 d后，待细胞汇合度达90%，加入皮质醇(Cortisol，100 nM)和地塞米松(Dexamethasone，Dex，100 nM)，48 h后，提取细胞总RNA用Master Pure RNA纯化试剂盒。反转录反应用2 μg总RNA，然后根据反转录试剂盒的说明操作。取1 μL反转录产物进行半定量的PCR反应，加入1 U的Phire Hotstart DNA聚合酶，1 mM的dNTP Mix，1倍的Phire反应缓冲液，0.2 μM 的引物(见表1)。PCR反应条件如下:初始变性时间98℃30 s;25个周期循环，98℃变性10 s，退火60℃15 s，延伸72℃15 s;最后一个延伸时间72℃10 min。最后，PCR产物全部用于1%凝胶电泳分离。
表1 实验所用引物1－all－re PCR 5＇－CAAGGCAGCTACAGTCAGGA －3＇5＇－CCCGGGGCCCAGAAAAATTAGGAG－3 ＇P1 －re 克隆 5＇－CCCGGGAGATTTCGAACAAATCTG－3＇P2 －fd 克隆 5＇－CCCGGGGAGAACCAGC
CATGTAAA－3＇P2 －re 克隆 5＇－CCCGGGCCGACAGGGAGCTG GCCT－3＇P1 －fd PCR 5＇－CAGATTTGTTCGAAATCTTGAGG－3 ＇P2 －fd PCR 5＇－CTGCCTGCTTAGGAGGTTGT －3＇HSD11B1－fd PCR 5＇－ACCAGAGATGCTCCAAGGAA－3＇HSD11B引物 应用 序列P1－fd 克隆
1.5 细胞转染 A549细胞用96孔板培养，传代1 d后，待细胞汇合度达90%，用无抗生素细胞液换液。质粒DNA(pGL3－P1和pGL3－P2，50 ng)分别用 25 μL Opti－ MEM Reduced Serum Medium 稀释待用，细胞转染试剂 LipofectamineTM2000(Invitrogen GmbH，Germany)0.3 μL 用 25 μL Opti－MEM Reduced Serum Medium稀释，混合后室温放置5 min。将已稀释好的质粒DNA与稀释好细胞转染试剂混合后室温放置20 min，然后将50 μL的混合物加入每孔中。将细胞板放入37℃细胞培养箱，4 h后，将稀释好的50 μL含有糖皮质激素Cortisol(100 nM)和 Dexamethasone(Dex，100 nM)的溶液，加入细胞培养孔中，将细胞放入细胞培养箱进行孵育。
1.6 荧光报告基因分析 在细胞转染后48 h，将96孔细胞培养板移出细胞培养箱移去细胞培养液，每孔加入75 μL细胞培养液。然后，每孔加入75 μL Luciferase Reagent(Promega，
Germany)，将细胞板上下左右来回轻轻晃动，10 min。然后将细胞裂解物转移到96孔白微孔板。测量firefly发光用 GENios Pro microplate reader(Tecan GmbH，Germany)。取出平板每孔加入75 μL Dual－GloTM＆ Glo Reagent(Promega，Germany)，轻轻混合后，放置10 min。Renilla发光测量使用GENios Pro microplate reader(Tecan GmbH，Germany)。结果分析:Relative luciferase activity(%)= RLUfirefly/RLURenilla(%)，其中RLU代表相对发光单位。
2 结果
2.1 GC诱导HSD11B1 mRNA的表达 糖皮质激素(GC)例如地塞米松(dexamethasone，Dex)和皮质醇(cortisol)都是非常重要的HSD11B1的调节子，可以诱导HSD11B1的表达。为了探讨GC诱导A549细胞中HSD11B1 mRNA的表达其选择性启动子的使用情况，设计特异性引物扩增来自不同启动子的转录产物(见图1)。A549细胞用地塞米松和皮质醇处理48 h后，用半定量－RT－PCR的方法检测GC诱导后HSD11B1 mRNA的表达情况。结果显示HSD11B1 mRNA表达显著增加经由选择性启动子P1和P2，但是P2要强于P1，GC主要通过介导P2诱导HSD11B1 mRNA表达(见图2)。
图1 设计引物检测HSD11B1选择性启动子(P1和P2)的使用情况
2.2 GC诱导荧光报告基因蛋白的表达 从A549细胞基因组中克隆11β－HSD1的两个启动子的基因序列，P1片段长为2.173 kb;P2片段长为2.506 kb(见图3)。将含有P1和P2启动子片段的荧光报告载体pGL3－P1和 pGL3－P2转染到A549细胞。经地塞米松和皮质醇处理后，检测荧光报告载体表达情况，结果显示，GC诱导的P2荧光报告载体相对荧光活性显著增加，然而P1荧光报告载体相对荧光活性没有明显变化(见图4)。
图2 半定量－RT－PCR检测HSD11B1转录产物
pgl3
图3 HSD11B1选择性启动子P1和P2的PCR产物
图4 GC诱导荧光报告基因的表达
3 讨论
一直以来人们对HSD11B1基因的启动子研究比较少，最近人们研究发现调控HSD11B1基因表达的启动子是由选择性启动子决定的。选择性启动子是指基因上游调控区存在的多个
启动子区，每个启动子所启动的表达模式不同，这些启动子的选择性启动在基因表达中起重要的调控作用。研究发现大约有52%的人类编码基因含有2个或者多个选择性启动子，平均每个人类编码基因含有3.1个选择性启动子［7］。最近人们对选择性启动子进行深入研究，发现选择性启动子在选择性剪接基因调控中起到了重要的调控作用［8］。HSD11B1基因表达也是由选择性启动子调控的，研究发现启动子P2在大多数组织和细胞基因转录中占主导地位，包括人类肝脏、皮下脂肪组织和几种常用的细胞系如 Caco－2、C2C12 和3T3 －L1［9］。转录来自于 P1调控的主要出现在人类的肿瘤细胞，如A431和HT－29。此外，C2C12成肌细胞和3T3－L1脂肪细胞分化的过程中，HSD11B1基因转录水平增加主要来自于P2转录增加［9］。本试验应用A549细胞系是人肺腺癌细胞系，通过实验发现选择性启动子P2在肺腺癌细胞中GC诱导HSD11B1表达过程中起主导作用。
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