基础医学与临床Basic & Clinical Medicine
January 2021Vol.41 No.1
2021 年 1 月 第41卷第1期
文章编号：1001-6325 ( 2021 ) 01-0013-07
研究论文
合成酶及激素敏感性脂肪酶基因启动子活性的影响
许瀚元，朱惠娟，潘 慧，阳洪波，王林杰，龚凤英*
收稿日期：2019-ll-29 修回日期：2020-04-28
基金项目：国家自然科学基金(81370898,30771026,30540036)；北京市自然科学基金(7182130,7082079)；人社部留学人员
科技活动项目择优资助经费(201401)(启动类)；高等学校博士学科点专项科研基金(20040023030)；国家临床重 点专科建设项目(WBYZ2011-873)；协和中青年科研基金(2013-020)
*
通信作者(corresponding author ) : fygong@ aliyun. com ； fygong@ sina
(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院内分泌科国家卫生健康委员会内分泌重点实验室，北京100730)
摘要：目的构建含人脂肪酸合成酶(FAS)及激素敏感性脂肪酶(HSL)基因启动子的荧光素酶报告基因表达质 粒，探究脂联素对人肝癌细胞系HepG2中FAS 及HSL 基因启动子活性的影响。方法扩增人FAS 及HSL 启动子 序列-622~+3 bp 片段与-697-+53 bp 片段，构建含人 FAS 及 HSL 启动子的 pGL3-hFAS625-Luc( hFAS 625-Luc)
与pGL3-hHSL750-Luc(hHSL 750-Luc)荧光素酶报告基因表达质粒。脂质体瞬时转染HepG2细胞，观察0. 5~
10. 0憾/mL 脂联素作用24 h 或者5憾/mL 脂联素作用2~32 h 细胞中荧光素酶活性的变化。结果hFAS 625-
Luc 与hHSL 750-Luc 荧光素酶表达质粒均能在HepG2细胞中良好表达。1. 0~ 10. 0憾/mL 脂联素作用24 h 能
剂量依赖性地促进转染hFAS 625-Luc 及hHSL 750-Luc 质粒的HepG2细胞中荧光素酶的表达，最高分别达到对
照组的1. 76倍(P <0. 01)和1. 37倍(P <0. 01)。5憾/mL 脂联素作用于转染hFAS 625-Luc 质粒的HepG2细胞
4h 和8 h 能够促进荧光素酶的表达(P <0.01)，作用16 h 和32 h 则抑制荧光素酶的表达(P <0.01)；而脂联素对
转染hHSL 750-Luc 质粒HepG2细胞作用不同时间(2~32 h)均能促进荧光素酶的表达，最高为对照组的1. 37倍
(P <0.01)。结论成功构建含人FAS 与HSL 启动子荧光素酶报告基因质粒。脂联素能够剂量依赖性地促进 HepG2细胞中FAS 及HSL 启动子活性。脂联素作对FAS 启动子的活性影响与作用时间有关，而对
HSL 启动子
活性的影响一直表现为促进作用。
关键词：脂联素；脂肪酸合成酶(FAS)；激素敏感性脂肪酶(HSL) ；HepG2细胞；启动子活性
中图分类号:R589
文献标志码:A
Effects of adiponectin on the gene promoter
activities of fatty acid synthase and hormone sensitive lipase in HepG2 cells
XU Han-yuan , ZHU Hui-juan, PAN Hui , YANG Hong-bo , WANG Lin-jie , GONG Feng-ying *
(Department of Endocrinology, Key Laboratory of Endocrinology of National Health Commission , Peking Lnion Medical College
Hospital, CAMS & PUMC, Beijing 100730, China)
Abstract : Objective To investigate the effects of adiponectin on human FAS and HSL gene promoter activities in
human hepatocarcinoma cell line HepG2 transfected with plasmids containing human FAS or HSL promoters fused to
a luciferase reporter gene. Methods The luciferase reporter gene expression plasmids pGL3-hFAS625-Luc(hFAS
14基础医学与临床Basic&Clinical Medicine2021.41(1)
625-Luc)and pGL3-hHSL750-Luc(hHSL750-Luc)were constructed.HepG2cells were then transfected with these plasmids by lipofectamine method.The FAS and HSL promoter activities was evaluated by testing the luciferase activity through incubation with0.5-10.0jg/mL adiponectin)for24h or5jg/mL adiponectin for232h.Results Both hFAS625-Luc and hHSL750-Luc plasmids were well expressed in HepG2cells. 1.010.0jg/mL adiponectin could progressively increase the luciferase expression in HepG2cells transfected with hFAS625-Luc and hHSL750-Luc plasmids with the maximum effect of1.76folds(P<0.01)and1.37folds of the controls,respectively,at the concentration of10.0jg/mL(P<0.01).Moreover,5jg/mL adiponectin promoted the expression of luciferase in HepG2c
ells transfected with hFAS625-Luc plasmids at4h and8h(P<0.01),and inhibited the expression of luciferase at16h and32h(P<0.01).Adiponectin promoted the expression of luciferase in HepG2cells transfected with HSL750-Luc within different durations(2~32h),and the highest was1.37 times of the control group at2h(P<0.01).Conclusions The luciferase reporter gene plasmids containing human FAS and HSL promoters are successfully constructed.Adiponectin promotes FAS and HSL promoter activities in HepG2cells with a dose-dependent manner.Adiponectin has a double effect on FAS promoter activity in different times，while it has a promoting effect on HSL promoter activity with different incubation durations.
Key words:adiponectin；fatty acid synthase(FAS)；hormone sensitive lipase(HSL)；HepG2cell；promoter activity
脂联素（adiponectin）是一种主要由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，主要作用于肝脏和脂肪组织，发挥调节脂代谢、增加胰岛素敏感性、抗感染等的作用［1］。研究发现，肥胖患者的血清脂联素水平降低［2］。脂联素过表达能使高脂饮食喂养的小鼠肝脏中三酰甘油含量下降，内脏脂肪组织减少［3］。进一步研究表明，脂联素能够通过调节脂肪合成与分解相关酶表达参与脂代谢的调节⑷。
脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）与激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase,HSL）分
别是在脂肪合成与分解过程中的关键限速酶［5］。研究报道，脂联素受体激动剂能够抑制C3H10T1/2小鼠间充质干细胞中FAS的表达［6］，而脂联素干预原代培养的脂肪细胞能够使细胞中HSL mRNA的表达量上升［7］。但关于脂联素对人肝细胞中FAS与HSL表达的影响目前尚无相关的文献报道。
本研究旨在通过构建含人FAS与HSL启动子的荧光素酶表达质粒，探究脂联素对人肝癌细胞系（human hepatocarcinoma cell line）HepG2细胞中FAS及HSL启动子活性的影响，为进一步揭示脂联素调节肝细胞脂代谢的作用提供实验依据。
1材料与方法
1.1试剂与材料
DMEM/NEAA培养基（Hyclone公司）；Opti-MEM减血清培养基（Gibco公司）；Lipofactamine TM 2000转染试剂（Invitrogen公司）；微孔板发光分析仪（北京滨松光子技术有限公司，BHP9504）；人血DNA提取试剂盒（Omega公司）；双荧光素酶测定试剂盒、pGL3-Basic质粒、pRL-SV40质粒及pBS-T质粒（Promega公司）；人肝癌细胞系HepG2（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）；重组人球形脂联素（Peprotech公司）；DNA测序由上海生工生物科技公司完成。
1.2方法
1.2.1细胞的分组与处理
1. 2.1.1构建pGL3-hFAS625-Luc荧光素酶表达质粒：PCR扩增FAS-（622~+3bp）片段，上游引物序列为：5'-TATTAACCACCCGTGTGCGCATTGGGCCG-3'，下游引物序列为：5'-CTCTAGGCCGGCGCCGA CGCTATTTAAAC-3'，产物大小为625bp，经测序证实为FAS基因启动子序列后，用T4DNA连接酶将这一片段插入过渡载体pBS-T中，然后用Sal I和Hind M同时双酶切这一质粒和pGL3-Basic质粒（不含启动子和增强子），分别得到带这两个双酶切位点的FAS启动子序列插入片段和pGL3-Basic载体片段，用T4DNA连接酶将二者连接，构建成含人FAS启动子（-622~+3bp）的pGL3-hFAS（-622~ +3bp）-Luc（hFAS625-Luc）荧光素酶表达质粒，并经测序证实序列正确。
许瀚元脂联素对HepG2细胞中脂肪酸合成酶及激素敏感性脂肪酶基因启动子活性的影响15
1. 2.1.2构建pGL3-hHSL750-Luc荧光素酶表达质粒:PCR扩增HSL(-697-+53bp)启动子，上游引物：5'-ATCTGTGGAATGACACGGGTGAATGAC-3,，下游引物：5'-CCTCCTAGGCATCTTCCGAGCTTCC-3'；产物大小为750bp，测序证实后采用和1.2.1.1中同样的方法，构建成含人HSL启动子(-697-+53bp)的pGL3-hHSL(-697~+53p)-Luc(hHSL750-Luc)荧光素酶表达质粒，并经测序证实序列正确。
1.2.1.3瞬时转染hFAS625-Luc及hHSL750-Luc 荧光素酶报告基因质粒及其活性测定：采用脂质体瞬时
转染法。将增殖状态良好的HepG2细胞以8x 10个细胞/孔接种于6孔板中，汇合度为50%~60%时，换为新鲜无血清DMEM/NEAA培养液，按本实验室已发表的文献操作⑻，配置含不同浓度目的质粒hFAS625-Luc或hHSL750-Luc质粒以及内参质粒pRL-SV40的A液和含Lipofactamine TM2000转染试剂的B液，将A、B两液混合，室温孵育20min后，加入上述准备好的HepG2细胞6孔板中，37°C CO2孵箱孵育5h后，更换为DMEM/NEAA培养基。40h后，加入1x报告基因裂解缓冲液，刮下细胞，离心5min，取20m L上清细胞裂解液，根据试剂盒说明书，加入100m L LARII荧光素酶反应试剂，检测萤火虫荧光素酶发光值，再加入100m L Stop&Glo试剂，测定海肾荧光素酶活性，计算两组数据的比值。每个标本重复检测3次，取每孔标本的平均值。将转染0Mg目的质粒的细胞的荧光素酶活性测定值为1，转染不同剂量目的质粒的细胞的荧光素酶活性与之相比得出相对荧光素酶活性。
1.2.2脂联素对FAS和HSL启动子活性的影响
1.2.2.1不同浓度脂联素对FAS和HSL启动子活性的影响：培养HepG2细胞，同样采用脂质体瞬时转染法，每孔细胞瞬时转染1.0Mg hFAS625-Luc或者hHSL750-Luc和0.07Mg pRL-SV40内参照质粒，转染结束后，更换为DMEM/NEAA培养基继续培养40h。将细胞分为实验组和对照组，对照组不做处理，实验组分别加入0.5、1.0、2.0、5.0及10.0Mg/mL 的脂联素，继续培养24h后，裂解细胞，按照1.2.1.3中描述方法检测荧光素酶活性，以不加脂联素干预的对照组荧光素酶活性为1，其他组与之相比得到相对荧光素酶活性。
1.2. 2.2脂联素作用不同时间对FAS和HSL启动子活性的影响：培养HepG2细胞，利用脂质体瞬时转染同等剂量的hFAS625-Luc或hHSL750-Luc和pRL-SV40内参照质粒，转染结束后继续培养40h。细胞分组及检测方法如1.2.2.1，其中实验组以5Mg/mL的脂联素干预细胞，分别在干预后的2、4、8、16、32h裂解细胞，检测细胞裂解液中荧光素酶的活性，计算得到相对荧光素酶活性。
1.3统计学分析
细胞实验设3孔重复，每个实验至少重复3次以上。数据以均数土标准差(“±s)表示，采用单因素方差分析。统计分析使用SPSS22.0软件，作图采用GraphPad Prism6.05软件。
2结果
2.1质粒的构建与鉴定
2.1.1成功构建含人FAS(hFAS)启动子序列的荧光素酶表达质粒：琼脂糖凝胶电泳鉴定，hFAS625-Luc质粒在紫外灯下可见约在5401bp有目的条带。重组质粒经双酶切可见载体(4776bp)和目的(625bp)片段(图1A)，将构建的质粒进行DNA测序，测序证实序列完全正确。
2.1.2成功构建含人HSL(hHSL)启动子序列的荧光素酶表达质粒：琼脂糖凝胶电泳鉴定, hHSL750-Luc质粒在紫外灯下可见约在5446bp有目的条带，重组质粒经双酶切可见载体(4696bp)和目的(750bp)片
段(图1B)，将构建的质粒进行DNA测序，测序证实序列完全正确。
2.2含hFAS和hHSL启动子序列质粒在HepG2细胞中的表达情况
2. 2.1hFAS625-Luc质粒在HepG2细胞中的表达情况：hFAS625-Luc质粒转染到HepG2细胞40h后能良好表达，荧光素酶的绝对值在十几万~几百万之间，而且随着质粒浓度的增加，荧光素酶的表达量进一步增高，峰值达到未转染目的质粒组的14.45倍(P<0.01)(图2A)。
2. 2.2hHSL750-Luc荧光素酶表达质粒在HepG2细胞中的表达情况:hHSL750-Luc质粒转染到HepG2细胞40h后能良好表达，荧光素酶的绝对值在几万-二十几万之间，而且随着质粒浓度的增加，荧光素酶的表达进一步增高，峰值达到未转染目的质粒组的&49倍(P<0.01)(图2B)。
16基础医学与临床Basic&Clinical Medicine2021.41(1)
A：pGL3-hFAS(-622~+3bp)-Luc(FAS625-Luc)plasmid,M1.DNA marker DL4000；M2.DNA marker DL2000, 1~3.established FAS625-Luc plasmid(5401bp),1',2',3'.fragments from pGL3-hFAS(-622~+3bp)-Luc (hFAS625-Luc)plasmid when digested by Sal I and Hind川(4776/625bp)；B:pGL3-hHSL(-697~3bp)-Luc (hHSL750-Luc)plasmid, 1.standard DNA molecular weight(1kb), 2.vector fragment from pGL3-hHSL-Luc plasmid when digested by EcoR I and Hind M(4696bp), 3.e
stablished hHSL750-Luc plasmid(5446bp),4.vector fragment from pGL3-basic plasmid digested by EcoR I and Hind皿(4696bp), 5.inserting fragment from hHSL750-Luc (750bp)plasmid digested by EcoR I and Hind^(750bp),6.standard DNA molecular weight:DL2000
图1质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定
Fig1Verification of plasmid by agarose electrophoresis
A.hFAS625-Luc plasmids；
B.hHSL750-Luc plasmids；*P<0.01compared with control group
图2不同量的质粒转染HepG2细胞后的荧光素酶表达情况
Fig2Luciferase activity of HepG2cells transfected with different amounts of plasmids(x±s,n=6)
2.3脂联素对转染hFAS625-Luc质粒的HepG2细胞中荧光素酶表达量的影响
2.3.1不同浓度脂联素对转染hFAS625-Luc质粒的HepG2细胞中荧光素酶表达量的影响：0.5憾/mL 的脂联素有促进HepG2细胞中荧光素酶表达的趋势，随着剂量逐渐增加，荧光素酶表达量也逐渐增加,1.
0,2.0,5.0和10.0Rg/mL的脂联素干预后荧光素酶表达量分别是对照组的1.18倍(P<0.01), 1.31倍(P<0.01),1.58倍和 1.76倍(P<0.01)。提示脂联素能够促进转染hFAS625-Luc质粒的HepG2细胞中hFAS启动子活性，且其促进作用呈剂量依赖性(图3A)。
2.3.2脂联素作用不同时间对转染hFAS625-Luc 质粒的HepG2细胞中荧光素酶表达量的影响: 5Rg/mL的脂联素干预瞬时转染hFAS625-Luc质粒的HepG2细胞4h及8h后，均能促进荧光素酶的表达荧光素酶表达，分别为对照组的1.31倍(P<0.01)和1.23倍(P<0.01)。而在作用16及32h后，脂联素对荧光素酶表达出现抑制作用，其荧光素酶表达量分别是对照组的0.87倍(P<0.01)及
许瀚元 脂联素对HepG2细胞中脂肪酸合成酶及激素敏感性脂肪酶基因启动子活性的影响
17
0. 67倍（P <0. 01），提示以脂联素对FAS 启动子活
性的影响与作用时间密切相关（图3B ）。
2.4
脂联素对转染hHSL750-Luc 质粒的HepG2 细胞中荧光素酶表达量的影响
2. 4. 1不同浓度脂联素对转染hHSL750-Luc 质粒的 HepG2细胞中荧光素酶表达量的影响：0. 5 jg/mL 脂
联素有促进HepG2细胞中荧光素酶表达的趋势，其
荧光素酶表达量是对照组的1-11倍。但随着浓度 逐渐增加，荧光素酶表达量逐渐增加，1.0、2.0、5.0
和10.0 jg/mL 脂联素干预后，细胞的荧光素酶表 达量分别达到对照组的1. 24倍（P <0. 01）,1. 28倍
（P <0.01）、1.29 倍（P <0.01）和 1.37 倍（P <0.01）,
提示脂联素能够促进瞬时转染hHSL750-Luc 质粒的 HepG2细胞中hHSL 启动子活性，且其促进作用呈
剂量依赖性（图4A ）。
2.4.2脂联素作用不同时间对转染hHSL750-Luc
质粒的HepG2细胞中荧光素酶表达量的影响: 5 jg/mL 脂联素干预瞬时转染hHSL750-Luc 质粒
的HepG2细胞2 h 能明显促进荧光素酶的表达,
达到对照组的1. 37倍（P <0. 01）。随着干预时间 延长，其促进荧光素酶表达的作用幅度没有继续 增强,4、8、16和32 h 后荧光素酶活性分别为对照 组的 1.24 倍（P <0.01）、1.21 倍（P <0.01）、1.22
倍（P <0.01）和1.23倍（P <0.01），提示以脂联 素干预能促进HepG2细胞中hHSL 启动子的活
性，且其促进作用在2 h 时达到顶峰，并在4~
32 h 时间区间内其促进作用没有随着时间延长
而增加（图4B ）。
-0-5-0-
520
A J o e
u s e j s g p n l
A £J
pgl3
»#
工
»#工
»#工
*P<0. 01 compared with control group ； *P <0. 01 compared with the prior group
图3不同浓度脂联素(A )与脂联素作用不同时间(B )对转染hFAS 启动子的HepG2细胞中荧光素酶活性的影响Fig 3 Effect of different concentrations (A ) and different action times (B ) on luciferase activity in HepG2 cells
transfected with hFAS 625-Luc plasmids (x±s , n = 6)
i
5
工
工
■°-
510Ol —I ——Ld ——Ld ——Ld ——Ld ——Ld ——L
0 0.5 1 2 5 10 (昭/mL)
A
*P<0. 01 compared with control group ； *P <0. 01 compared with the prior group
图4不同浓度脂联素(A )与脂联素作用不同时间(B )对转染hHSL 启动子的HepG2细胞中荧光素酶活性的影响Fig 4 Effect of different concentrations (A ) and different action times (B ) on luciferase activity in HepG2 cells
transfected with hHSL 750-Luc plasmids (x±s , n = 4)
i
i
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