吸波面积－高效液相结合法对川芎组分片中整体和个体成分溶出度的研究 Research on effects of the absorbing area plus HPLC on dissolution of overall and individual components of Chuanxiong constituent tablets
赖宏强胡悦李孝栋*
（福建中医药大学，福建福州，350122）
中图分类号：R228 文献标识码：A 文章编号：1674-7860（2015）14-0006-05
【摘要】目的：建立吸波面积－高效液相结合测定川芎组分片中整体和个体药物成分溶出度的测定方法。方法：采用转篮法，以水为溶出介质，转速50r·min-1，通过吸波面积结合高效液相测定川芎组分片在第5、10、20、30、45、60min累积溶出量，并比较两种方法的测定结果。结果：吸波面积法和高效液相谱法测得川芎组分片中整体成分、阿魏酸钠、盐酸川芎嗪在水介质中第60min平均累积溶出度分别为100.09%、99.54%、99.98%，不同时间整体成分的累积溶出量与两者药物累积溶出量之和均较接近，两种方法的相似因子f2为91，说明吸波面积法测得的川芎组分片中整体成分的溶出行为与高效液相法测得的个体成分之和的溶出行为相似。结论：吸波面积法可用于中药中整体成分的溶出度考察，同时结合高效液相谱法测定中药中个体成分的溶出度，对复杂体系下的西药联合用药、组分中药中整体和个体成分溶出度的研究将起到较好的指导作用，并为其体内研究提供了科学思路和可行途径。
【关键词】川芎组分片；吸波面积；高效液相；溶出度
【Abstract】Objective: To establish a method for determination of dissolution on total composition and individual material in tablet of rhizomes of ligusticum chuanxiong components by the combination method of area under the absorbance-wavelength curve (AUAWC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Methods: The basket method was used. Regarding water as dissolution medium, and the speed was 50r·min-1. The cumulative dissolution quantity at 5,10,20,30,45 and 60 min of tablet of rhizomes of ligusticum chuanxiong components by the combination method of AUAWC and HPLC, which compare with the result of two methods. Results: The cumulative dissolution in vitro of total composition, ligustrazine hydrochloride and sodium ferulate of tablet of rhizomes of ligusticum chuanxiong components at 60 min was 100.09%, 99.54% and 99.98% respectively in water by AUAWC and HPLC. The final dissolution quantity of total composition was the closer to the total quantity of two individual drugs in different time. Similarity factors f2 is 91 between AUAWC and HPLC. The dissolution curves and behavior of total drug of tablet of rhizomes of ligusticum chuanxiong components by AUAWC were similar to the sum of individual material by HPLC. Conclusion: Dissolution on total composition and individual material in tablet of rhizomes of ligusticum chuanxiong components could be studied by the combination metho
d of AUAWC and HPLC respectively, which can will provide better guidance to study combination therapy of western medicine under complex system and the in vitro dissolution of the total composition and individual material in components of TCM medicine, and provide a scientific idea and feasible way for its in vivo study.
【Keywords】Chuanxiong constituent tablets; AUAWC; HPLC; Dissolution
doi:10.3969/j.issn.1674-7860.2015.14.003
川芎是伞形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong hort）的干燥根茎，其有效成分主要有川芎嗪和阿魏酸等[1~6]。本课题组在盐酸川芎嗪和阿魏酸钠的稳定性和溶解度比川芎嗪和阿魏酸大，以及阿魏酸与川芎嗪配伍使用的效果比单用的阿魏酸与川芎嗪更为显著的基础上[7,8]，结合组分中药的理论[9]，以阿魏酸钠和盐酸川芎嗪为原料，对其制备成的组分中药制剂——川芎组分片开展溶出度的研究。
溶出度系指活物从片剂、胶囊剂或颗粒剂等固体制剂在规定条件下溶出的速率和程度[10]。药物溶出度检查可以在一定程度上反映主药的晶型、粒度、处方组成、辅料品种和性质、生产工艺等的差异，也是评价制剂活性成分生物利用度和制剂均匀度的一种有效标准[11]。对于西药的溶出度考察，报道的文献较多[12~15]，方法较为成熟，而中药制剂的溶出度考察虽有报道[16~18]，但多数是以中药或中药复方中某一成分作为溶出指标，不能很好地反映中药中整体成分的溶出行为。而测定中药中整
体成分溶出度的方法尚未见报道，因此本文提出吸波面积法尝试性解决中药整体成分溶出考察问题。
所谓吸波面积，指的是药物经紫外－可见吸收光谱全波长扫描后获得的吸光度与波长曲线下面积（英文为Area Under the Absorbance-wavelength Curve，简写AUAWC），公式为AUAWC
＝△Aλ，假设波长λ可以均分，且λ均分值＝1nm，则AUAWC ＝△A，即AUAWC为每隔1nm的吸光度值的总和；由于吸光度具有加和性，结合比尔定律（A＝ΕCl），可得：△A＝A1＋A2＋A3＋……A选取特定波长＝Ε1（C1＋C2＋C3＋……C选取特定波长），C总＝C1＋C2＋C3＋……C选取特定波长，E1为常数m，则AUAWC＝m C总，即吸波面积和中药中整体成分的总浓度成正比，可应用于中药复方制剂体外整体成分含量测定的研究，进而测定各时间点下整体成分的溶出情况。
本实验在课题组已经建立了较好的试验基础上[19~23]，通过吸波面积与高效液相结合的方法，测定川芎组分片中阿魏酸钠和盐酸川芎嗪两种成分的整体药物和各自单一成分的溶出度累积溶出量，并比较两种方法得到的片剂整体成分溶出行为，为复方制剂中整体和个体成分体外溶出度的比较性研究提供可行性。
1 材料
1.1 仪器
AR2140十万分之一电子天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）；FA604A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；RCZ-6C1药物溶出仪（上海黄海药检仪器厂）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；LC-20A T高效液相谱仪（日本岛津公司）；KQ-500E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试剂
阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110773-201012）；盐酸川芎嗪对照品（中国食品药品检定研究院，批号110817-200305）；阿魏酸钠原料（苏州市立德有限公司，批号20130115）；盐酸川芎嗪原料（福建天泉药业股份有限公司，批号110601）；川芎组分片（福建中医药大学药剂实验室制备，批号20140929）；甲醇（山东禹王实业有限公司，谱纯，批号20140323103）；冰醋酸等。均为分析纯。
吸波2 方法与结果
2.1 川芎组分片溶出度考察
2.1.1 溶出介质的选择
本品为普通片剂，参考2010版《中国药典》中阿魏酸钠片和磷酸川芎嗪片做溶出时用到的介质为水，
所以本片剂考察溶出度也选用水作为溶出介质[10]。
2.1.2 溶出样品采集
采用2010年版《中国药典》（二部）附录X项下溶出度测定法第一法（篮法）测定溶出度[10]。以水为溶出介质，加热至（37±0.5）℃，转速50r·min-1。分别在第5、10、20、30、45、60min取样10mL，经0.45μm的微孔滤膜过滤后备用。同时立即补加同温等量的10mL溶出介质。
2.2 吸波面积法
2.2.1 辅料干扰考察
取3片川芎组分片，研细，混合均匀，精密称取一片量，再精密称取等同于一片但除去药物原料的辅料内容物一份，分别放入已经装有900 mL水的溶出杯中，加热至（37±0.5）℃，转速为50r·min-1。在第60min时分别取样10mL，经0.45μm 的微孔滤膜过滤后取续滤液备用。按照紫外分光光度法，以水为空白对照，在200～600nm进行全波长扫描，Origin 8.0软件拟合并计算出AUAWC。得到空白辅料的AUAWC为2.802，药片全组分的AUAWC为645.796，可以看出辅料对于紫外吸收测定影响很小，空白辅料的AUAWC值为药片全组分的0.43%，可以忽略不计。所以在测定片剂的溶出度的时候，可以不考虑辅料的吸收。
2.2.2 标准曲线的绘制
精密称取阿魏酸对照品3mg、盐酸川芎嗪对照品1.5mg，置25mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得总浓度为180μg·mL-1的混合对照品储备液。分别精密吸取储备液0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、3mL于10mL量瓶内，用水稀释并定容至刻度，配成总浓度分别为0.9、1.8、9、18、27、36、54 μg·mL-1的混合对照品溶液。按照紫外分光光度法，以水为空白，在200～600 nm进行全波长扫描。以AUAWC为纵坐标，混合药物浓度（C）为横坐标，进行线性回归，得到回归方程AUAWC＝6.1557C＋9.4793（r＝0.996）。表明混合药物总浓度在0.9～54μg·mL-1，线性关系良好，如图1所示。
图1混合对照品全波长扫描图（从下到上总浓度依次增加）
2.2.3 精密度
将混合药物总浓度为36 μg·mL-1的对照品溶液，按照紫外分光光度法，以水为空白，在200～600nm进行全波长扫描6次，Origin8.0软件拟合并计算出AUAWC。结果RSD为1.31%，表明本仪器精密度良好。
2.2.4 稳定性
取在水介质中10min溶出的供试品溶液，分别于第0、1、2、4、5、6、18h进行全波长扫描，Origin8.0软件拟合并计算出AUAWC，计算RSD值为1.20%。表明溶出样品至少在18h 内稳定。
2.2.5 重复性
取同一批次川芎组分片同一时间点（10min）溶出样品6份，进行全波长扫描，Origin8.0软件拟合并计算出AUAWC，计算RSD值为2.53%，表明该方法重复性良好。
2.2.6 加样回收率
精密量取在水中溶出5min供试品溶液6份（混合药物总浓度为13.70μg·mL-1），每份1mL，置于10mL容量瓶中，分别精密加入0.7mL浓度为18μg·mL-1混合对照品溶液，加水定容至10mL。混合均匀后，进行全波长扫描，Origin8.0软件拟合计算出AUAWC。将AUAWC带入标准曲线求出混合后的样品浓度，计算加样回收率。结果平均加样回收率为101.28%，RSD 为3.50%，表明本法具有良好的回收率。
2.2.7 样品溶出度的测定
取川芎组分片6片，按“溶出样品采集”下方法采集样品，按照紫外分光光度法，以水为空白对照，在200～600nm 进行全波长扫描。以累积溶出度为纵坐标，时间（T ）为横坐标，绘制累积溶出曲线，见图2。
图2 川芎组分片整体药物累积溶出曲线（n ＝6）
2.3 高效液相谱法 2.
3.1 谱条件
谱柱：Diamonsil C18（4.6mm×200mm ，5μm ）；阿魏酸与盐酸川芎嗪均以甲醇－0.5%醋酸水溶
液（28：72）为流动相[24,25]，阿魏酸检测波长均为322nm ，盐酸川芎嗪检测波长为296nm ，流速：1.0mL·min -1；柱温：30℃；进样体积：10μL 。 2.3.2 专属性考察
分别取对照品溶液、溶出样品供试品溶液和空白辅料溶液按照2.3.1项下的谱条件进行检测，观察谱图中各成分的分离情况。在上述谱条件下，样品中的各组分均达到基线分离，分离度均大于1.5，供试品溶液中辅料对阿魏酸（钠）、盐酸川芎嗪谱峰的测定无干扰，具体谱图见图3。
A B C
图3 空白辅料、对照品溶液与供试品溶液HPLC 图 A ：空白辅料 B ：对照品溶液 C ：供试品溶液
1-阿魏酸，2-盐酸川芎嗪
2.3.3 标准曲线的绘制
精密称取阿魏酸对照品3.0 mg ，盐酸川芎嗪对照品1.5 mg ，置于25mL 的量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得阿魏酸/盐酸川芎嗪浓度为120/60μg ·mL -1混合对照品储备液。分别精密吸取储备液0.5、1、2、3、4mL 于10mL 量瓶内，用水稀释并定容至刻度，配成阿魏酸/盐酸川芎嗪浓度分别为6/3、12/6、24/12、36/18、48/24μg ·mL -1的混合对照品溶液，按照2.3.1项下的谱条件进行实验，以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得各成分的回归方程和相关系数，具体表现为阿魏酸Y ＝48 127C -245 180（r ＝0.999 6），在6～120μg ·mL -1范围浓度和峰面积呈现良好的线性关系；盐酸川芎嗪Y ＝20 282C -22 473（r ＝0.999 8），在3～60μg ·mL -1范围内呈现良好的线性关系。 2.3.4 精密度
将取阿魏酸/盐酸川芎嗪混合对照品溶液（36/18μg ·mL -1）按照上述谱条件平行进样6次，每次进样10μL ，测定相应峰面积，结果阿魏酸/盐酸川芎嗪RSD 分别为0.19%、1.98%，表明仪器精密度良好。 2.3.5 稳定性
取在水介质中10min 溶出的供试品溶液，室温静置0、2、4、6、12h 后分别进样分析，计算阿魏酸钠、盐酸川芎嗪面积的RSD %，以考察对照品溶液的稳定性。结果阿魏酸钠、盐酸川芎嗪峰面积的RSD 分别为0.62%、1.89%，表明供试品溶液在12h 内基本稳定。 2.3.6 重复性
取同一批次川芎组分片同一时间点（10min ）溶出样品6份，进行进样分析，结果阿魏酸钠、盐酸川芎嗪RSD 分别为1.72%、1.27%，表明该方法重复性良好。
2.3.7 加样回收率
精密量取在水中溶出10min 供试品溶液6份（阿魏酸/盐酸川芎嗪浓度为20.06/12.34μg ·mL -1）
，每份取0.5mL 加入置于10mL 容量瓶内，分别精密加入24/12μg ·mL -1的阿魏酸/盐酸川芎嗪混合对照品溶液0.5mL ，加水定容至10mL 。结果阿魏酸、
、102.40%，
RSD
分别为2.24%、
3.47%（n
＝6
），表明加样回收率结果良好。
2.3.8 样品溶出度的测定
取2.2.7
项下采集的川芎组分片溶出样品，按2.3.1
项下的谱条件进行含量测定，以峰面积代入回归方程中计算样品浓度，并计算阿魏酸钠、盐酸川芎嗪溶出度。以累积溶出度为纵4。
图4 川芎组分片2种成分的累积溶出曲线（n ＝6）
（A ：阿魏酸钠，B ：盐酸川芎嗪）
3 两种方法结果的比较
3.1 吸波面积法与高效液相谱法累积溶出量比较
取在水中溶出5、10、20、30、45、60min 的样品，分别按吸波面积法和高效液相谱法对其中的整体成分和个体成分的溶出量进行测定，具体结果见表1。由表1可知，川芎组分片重混合总药物不同时间的累积溶出量与阿魏酸钠、盐酸川芎嗪两者药物累积溶出量之和较为接近。
3.2 吸波面积法与高效液相谱法下溶出行为相似比较
将两种方法分别得到的各时间点川芎组分片整体成分的
平均累积溶出度，绘制相应的溶出曲线，见图 5，并以高效液相法得到的个体成分加和的平均累积溶出度作参比，根据相似因子f 2＝50×lg[（1＋Q /n ）-
0.5×100]（其中n 为所取时间点的个数，Q ＝∑（Y RT －Y TT ）
，Q 为高效液相与吸波面积法测得的平均累积溶出度的方差和，Y RT 与Y TT 分别为t 时间点高效液相与吸波面积测得的平均累积溶出度）[26]，比较两种方法下测出的片剂整体成分溶出行为的相似性[27]，结果f 2＝91，>50，说明两种方法得到的药物整体成分与个体成分加和的溶出行为相似。
表1 吸波面积法与高效液相谱法累积溶出量的比较
组别
吸波面积法
高效液相法
整体成分（mg ）
阿魏酸钠（mg ）
盐酸川芎嗪（mg ）
加和（mg ）
5min 27.57 21.11 6.04 27.15 10min 66.08 60.66 12.21 72.87 20min 91.44 77.72 20.72 98.44 30min 101.15 84.34 23.39 107.73 45min 103.00 84.90
25.32 110.22 60min 108.28 89.80
25.79 115.59
图5 不同方法下测得的川芎组分片整体药物溶出曲线
4 讨 论
根据吸波面积与高效液相，分别得到的6 片川芎组分片的整体成分与个体成分各时间点的溶出度和累积溶出曲线可以看出，样品的溶出均一性良好，川芎组分片各片溶出趋势一致，从第二时间点开始，整体成分与各单一成分溶出量的RSD 值均不超过10%[28]。
实验前期，在利用吸波面积测定同一片川芎组分片中的总
药物含量会比高效液相测得的阿魏酸钠与盐酸川芎嗪总含量要低些，所以在测定同一片川芎组分片的溶出度时，得到的混
合总药物不同时间的累积溶出量会比阿魏酸钠、盐酸川芎嗪两者的药物累积溶出量之和要低些，但总
体两种方法测得的累积溶出量较为接近。
本品6片试验结果说明，吸波面积法和高效液相谱法测得川芎组分片中整体成分、阿魏酸钠、盐酸川芎嗪在水介质中在第60min平均累积溶出度分别为100.09%、99.54%、99.98%，RSD值为0.29%（n＝3），并且两种方法得到的药物整体成分溶出行为相似，表明两种方法具有较好的关联性。说明吸波面积－高效液相谱结合法对整体成分和个体成分体外溶出度的测定提供了较好的方法学上的指导。
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基金项目:
福建省科技厅中药学重点实验室平台，福建省科技计划项目2010Y2004。
作者简介：
赖宏强，男，硕士研究生，研究方向为中药制剂及质量控制。
李孝栋，通讯作者，男，药剂学博士，教授，研究方向为中药物质基础、药物制剂及其药代动力学。
编辑：段苏婷编号：EA-150202001（修回：2015-05-16）
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