郑楠;郭庆焕;何亚辉;钱泓;赵东;陈叶福;郭学武;肖冬光
【摘 要】通过缺失乙酰辅酶A水解酶(ACH)基因和过表达乙酰辅酶A合成酶(ACS)基因技术提高酿酒酵母合成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)能力的同时,过表达醇酰基转移酶(ATF)基因,提高乙酸乙酯合成能力,并考察acetyl-CoA含量对酿酒酵母合成乙酸乙酯能力的影响.结果表明,敲除ACH1基因、且在敲除ACH1基因基础上过表达ACS1、ACS2基因均能提高酿酒酵母Acetyl-CoA含量,进而提高乙酸乙酯含量.较亲本菌株α5,缺失突变株α5AACH1、重组菌株α5-A1、α5-A2的Acetyl-CoA的含量均分别提高了52.5％、80.33％、52.79％,乙酸乙酯含量分别提高10.59％、26.12％、23.70％.在敲除ACH1基因、过表达ACS1和ACS2基因的基础上同时过表达ATF1基因,得到工程菌株A1-ATF1和A2-ATF1,较亲本菌株α5,乙酸乙酯含量分别提高226.09％、530.43％、289.57％,工程菌株A1-ATF1乙酸乙酯产量最高,为72.52 mg/L.研究表明,提高乙酰辅酶A含量能够促进乙酸乙酯的合成,为提高乙酸乙酯生成量提供了新思路. 【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2018(037)005
【总页数】7页(P150-156)
【关键词】乙酰辅酶A;乙酸乙酯;醇乙酰基转移酶;基因敲出;基因过表达
【作 者】郑楠;郭庆焕;何亚辉;钱泓;赵东;陈叶福;郭学武;肖冬光
【作者单位】天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室,四川宜宾644000;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457
【正文语种】中 文
【中图分类】Q552
白酒是世界六大著名蒸馏酒之一，历史可追溯至数千年。白酒中的微量风味物质是影响白酒品质的主要因素，约占1%～2%，其中酯类物质又占微量成分的60%～90%，因此提高白酒的酯含量对于形成白酒风味典型性具有非常重要的意义[1-2]。乙酸乙酯是清香型白酒的主体香味成分，适量的乙酸乙酯能够使得酒体丰满、柔和、香味协调，其含量的高低直接决定清香型白酒品质的好坏。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae）是白酒酿造过程中重要的发酵微生物，但产乙酸乙酯较少，清香型白酒中生成乙酸乙酯的主要微生物是产酯酵母，但产酯酵母产酒精能力弱，增加粮耗，且大多数为好氧微生物，液态发酵会阻止产酯作用的进行，因此通过改造酿酒酵母提高乙酸乙酯产量具有重要意义。研究表明[3]，酵母合成乙酸酯类有两种途径，一种是在酵母自身所含有的少量酯化酶的作用下，催化乙酸和乙醇直接合成乙酸乙酯；另一种是乙醇和酰基辅酶A在醇酰基转移酶的作用下在酿酒酵母细胞内生物催化生成相应的酯类，这是酿酒酵母中乙酸酯类的主要合成途径。对于液体发酵，乙酸乙酯的形成依赖于底物乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）、乙醇的浓度和醇乙酰基转移酶的活性。
乙酰辅酶A是工业生产上合成胆固醇、酮体和脂质等许多重要产品的前体物。在酿酒酵母中，不同的细胞区隔，如线粒体、胞液和过氧化物酶体中均能产生乙酰辅酶A。在胞液中，
丙酮酸经过丙酮酸脱羧酶、乙醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶的催化作用形成乙酰辅酶A。乙酰辅酶A合成酶（acetyl coenzyme A synthetase，ACS）基因由ACS1和ACS2两个基因编码[4]。乙酰辅酶A水解酶（acetyl coenzyme Ahydrolase，ACH）由ACH1基因编码，催化乙酰辅酶A水解为乙酸和辅酶A，可参与细胞内乙酰辅酶A调节[5]。
目前国内外学者提高乙酸乙酯的含量主要是通过筛选高产乙酸乙酯菌株[6]或者利用基因工程手段过表达醇酰基转移酶（alcohol acyltransferase，ATF）基因ATF1、ATF2和Lg-ATF1[7-11]。DONG J等[12]通过调节ATF1基因的启动子强度使白酒中乙酸乙酯的含量提高了3.1倍。ZHANG C Y等[13]在工业啤酒酵母中通过转化多拷贝质粒过表达ATF1基因，使乙酸乙酯的产量增加为原来的9倍。提高醇酰基转移酶能够在一定程度上提高乙酸乙酯的生成量，但其限制因素还包括底物乙酰辅酶A和乙醇的浓度，酿酒酵母进行酒精发酵会产生充足的乙醇，所以乙酰辅酶A的含量是最根本的限制因素。综上，通过提高底物乙酰辅酶A的含量来提高乙酸乙酯生成量是一个可行的思路。同时，也为其他以乙酰辅酶A为底物的产品生产奠定了基础。因此，本研究通过敲除ACH1基因降低乙酰辅酶A的分解，过表达ACS1和ACS2基因增强乙酰辅酶A合成酶的活性，过表达ATF1基因提高底物乙酰辅酶A含量，进而提高乙酸乙酯的生成量。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株和质粒
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY15的单倍体菌株α5：天津科技大学天津市工业微生物重点实验室保藏；游离表达质粒Yep352、过表达ATF1基因的质粒PABBK和带有酿酒酵母磷酸甘油激酶基因（PGK1）强启动子的质粒Yep-PGK1、pGAPza质粒：本实验室保藏；质粒pUG6：德国Hegemann教授惠赠。ACS1/ACS2基因来自于酿酒酵母α5。
1.1.2 培养基及培养条件
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。
LB培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L。
以上两种培养基，自然pH值，固体培养基加2%琼脂，121℃灭菌15 min。
半乳糖诱导液态培养基：半乳糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，121℃灭菌15min。
一级种子培养基：糖度为8°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。
二级种子培养基：糖度为12°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。
aaaaaaaaaaaaaaaaaa发酵培养基：60 g玉米粉按1∶3（g∶mL）的料液比加水，70℃糊化20 min，加30 μL淀粉酶85～90℃液化90 min，加适量营养盐和酸性蛋白酶及90 μL糖化酶55～60℃糖化20 min后制得。
1.1.3 试剂和酶
淀粉酶（29万U/mL）、糖化酶（10万U/mL）：诺维信生物技术有限公司；酸性蛋白酶（10万U/mL）：尤特尔生化有限公司；苹果酸脱氢酶（1200U/mg）、柠檬酸合酶（1000U/mg）、限制性内切酶（10 U/μL）、rTaq聚合酶（5 U/μL）、脱氧核糖核酸（de
oxyribonucleic acid，DNA）连接酶（350 U/μL）、博来霉素（Zeocin）、遗传霉素（G418）、Rever TraAceRqPCR RT Kit：宝生物工程（大连）有限公司；卡那霉素抗性基因（KanMX）：德国Merck公司；酵母基因组DNA提取试剂盒、酵母核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；引物：金唯智生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
PCT-200型聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增仪、DYY-4c型电泳仪：美国BIO-RAD公司；Reference-2型移液：法国吉尔森公司；7890型气相谱（gas chromatography，GC）仪、1260型号高效液相谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦科技有限公司；StepOnePlusTM实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）仪：美国ABI公司。
1.3 方法
1.3.1 突变菌株的构建
（1）引物设计
根据GenBank中ACH1、ACS1、ACS2和ATF1基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0软件设计PCR反应引物见表1。所有引物均由金唯智生物科技有限公司合成，酶切位点以下划线表示。
表1 试验所用PCR引物Table 1 PCR primers used in the study引物 序列（5′→3′） 酶切位点AK-U菌株构建BK-D K-U ACTAGACAATAGCGGCAAAACAAACAACACATTTCTTTTTTTCTTTTTCACATATTGCACTAAACAGCTGAAGCTTCGTACGC ATAATCATATCATTTCCTTTCTTTTTTTTGTTAAATACTCATCTCTCGGTTTGCGCACAAACAGCATAGGCCACTAGTGGATCTG ACATGCATGCCAGCTGAAGCTTCGTACGC SphI
续表注：上游引物用U表示，下游引物用D表示。RT-qPCR的上游引物用F表示，下游引物用R表示。引物 序列（5′→3′） 酶切位点K-D ACATGCATGCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG SphI ACS1-U CCGCTCGAGATGTCGCCCTCTGCCGT XhoI ACS1-D CCGCTCGAGTTACAACTTGACCGAATCAATTA XhoI ACS2-U CCGCTCGAGATGACAA
TCAAGGAACATAAAGTAG XhoI ACS2-D CCGCTCGAGTTATTTCTTTTTTTGAGAGAAAAATTGG XhoI AP-U PGK1-U ACTAGACAATAGCGGCAAAACAAACAACACATTTCTTTTTTTCTTTTTCACATATTGCACTAAATCTAACTGATCTATCCAAAACTGA TCCCCCGGGTCTAACTGATCTATCCAAAACTG SmaI KAN-D A-U A-D B-U B-D A'-D ACS1-F ACS1-R ACS2-F ACS2-R ACT1-F ACT1-R TCCCCCGGGGCATAGGCCACTAGTGGAT SmaI P C R验证 R T-q P C R CCGCAACAGCCAATCC TTCCGTCAGCCAGTTTAGTC ATGCGTCAATCGTATGTG TGCGGAGAAGGCTGT TCTGTGGCGGTCTATCA CCAAGGCTATTCCATTAC TGACTTTACCACCTCTGTT GGGATGCTCCATACACC GCAATGACCGCTTCTG CGTCTGGATTGGTGGTTCTA GTGGTGAACGATAGATGGAC
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