950
西"农业学&
Southwest China Journal of Agecultural Sciences
2021345
Vol.34No.5
文章编号：1001-4829(2021)5-0950-06DOI：10.16213//cnki.scjas.2021.5.007不同VIGS体系在棉花中沉默效率的研究 吴洁1，刘帅1，马晶晶3，杨兆光t乔艳艳1，赵沛1，吴珍平操宇琳1，张朝军2
(1-江西省棉花研究所/国家棉花产业技术体系鄱阳湖综合试验站，江西九江332105;2.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000；3.塔里木大学，新疆阿拉尔843300)
摘要：！目的】比较不同病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系在棉花中的沉默效率。【方法】本研究以35S宕动子驱动的抗卡那霉素基因npG为目标基因，利用RNA病毒裁体TRV+DNA病毒裁体CLCrV构建基因 沉默裁体，研究这2套VIGS体系在棉花中的基因沉默效率和沉默持续时间的差异。【结果】TRV体系比CLCO体系沉默效率高，TRV体系比CLCO体系沉默持续时间短，CLCO体系能够在棉花蕾、花、花药等生殖器骨中发挥沉默作用。【结'】TRV病毒沉默体系主要适用于短期的棉花内源基因的沉默,CLCO病毒沉默体系适用于研究棉花生长发育后期生殖生长相关的基因功t。本研究为棉花选取合适的VIGS体系提供参考，对研究棉花基因功t具有重要意义。
关键词：棉花;VIGS;TRV裁体;CLCrV t体
中图分类号:S562文献标识码:A
Silencing Efficieiicy of Different VIGS Systems in Cotton
WU Jie1%LII Shuai1%MA Jing-jing3%YANG Zhao-5uang1%QIO Yan-yan1%ZHAO Pet%
WU Zhen-ping%CAO Yu-lin1%ZHANG Chao-jun2*
(1-Cotton Research Institute of Jianyxi Pwince/Poyang Lake Comprehensive Test Station of National Cottonindustrial Technology System, Jiangxi Jiujiang332105,China；2-Cotton Research Institute of Chinese Academy of Agecultural Sciences/National Key Laboratoo of Cotton Biology,Henan Anyang455000%China；3.TaOm University,Xinjiang Alar843300,China)
Abstract:[Objective]The present paper aimed to compare the silencing e/iciency of ddferent virus-induced gene silencing systems in cotton-【Method]35S promoter-driven npt(o f kanamycin resistance gene was used as taraet genes totwo gene silencing vector systems TRV-VIGS(RNA vies vgc W v)and CLC i V-VIGS(DNA vies vectors)to study the ddferences in gene silencing e/iciency and silencing duration betseen the two VIGS systems in cotton.【Result]The TRV system was more efficient Pan the CLCrV system in the shot term,and the TRV system was less0X46/than the CLCrV system on silencing duration.The CLCrV system was able to silence the reproductive organ related genes such as flower bud,flower,anther and so on.【Conclusion]TRV vivs silencing system4suitabU for inducing the silencing of endogenous genes in early cotton plants,and CLCrV virus silencing system4suitable for studying the silencing of endogenous genes related eoaepaoduceivegaoweh ehaepeayaeong-eeam aoeein coeon gaoweh and deveeopmene.Thisseudypaovidesaaeoeaenceooaeheseeeceion oosuie-abeeVIGS syseemsooacoeon,which isoogaeaesignioicanceeoeheseudyoocoeon geneounceion.
Key words：Cotton；VIGS；TRV vector；CLCrV vector
【研究意义］病毒诱导的基因沉默(Virus induced yena silenciny,VIGS)技术是20世纪90年代兴起的一种高通量、高效、快速的反向遗传学技术。其原理是目标基因接入病毒载体，形成重组病毒后侵染植 株，目标基因片段转录成dsRNA，随后dsR-
收稿日期：2020-06-24
基金项目：江西省重点研发计划(20181BBF60001)；国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-15-58)
作者简介：吴洁(1991-)，女，硕士研究生，助理研究员，主要从事棉花分子育种及植保方向研究，E-mail:wjie19910319@ 126-com；*为通讯作者：张朝军，E-mail：zcj1999@yeah&NA被内切酶Dicav类似物切割成21-24ni的/4s NA,s i4NA在植株中与一些特定的蛋白质相结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silenciny complex,RISC),RISC与同源RNA互作，目标基因mRNA降解［1-。本文选用的2个VIGS体系棉花叶皱缩病毒(Cotton Urf cvmpla virus,CLCrV)载体和烟草脆裂病毒(Tobrcca rattla vivs,TRV)载体是棉花中常用的2种VIGS体系。通常2种载体都可以通过沉默叶绿素合成基因，从而得到植株的白化表型［4_5］O【前人研究进展］TRV载体是自2001年
5吴洁等：不同VIGS体系在棉花中沉默效率的研究951
以来运用最广泛的VIGS载体,G片等⑷在2011年将RNA病毒TRV介导的VIGS体系运用于研究棉花的基因功能。Tuttle等⑸在2008年通过用粒子轰击和农杆菌介导的方法建立了棉花中的DNA病毒CLCrV介
导的VIGS体系。TRV体系在植株中的沉默持续时间短，而CLCrV体系表型可维持在棉花的整个生育期中［7_8］，但对2个VIGS体系在棉花不同发育时期和不同部位沉默效率的研究较少。新霉素磷酸转移酶基因!nemyc-phosphotransferass(,npt ()是转基因植物中常用的选择性标记基因，它通过合成新霉素磷酸转移酶对卡那霉素(1〈片)产生抗性。利用VIGS技术沉默转基因植株中的npI I基因会使得转基因植株丧失K片抗性［9］&【本研究切入点】本研究以35S启动子驱动的抗Kan的nptG基因为目标基因，构建2种VIGS体系介导的基因表达沉默载体，通过农杆菌注射法侵染棉花子叶，对2个VIGS体系侵染的棉花植株不同时期及不同部位进行qRWPCR检测&【拟解决的关键问题】比较2套VIGS在棉中的基沉默和沉默时的差异，为验证棉花基因功能选取合适的VIGS体系提供参考，对棉花基因功能的研究具有重要意义&
1材料与方法
1-1试验材料
本研究使用的棉花材料为含有抗Kan npt II基因的常规陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种中棉所41(CCRI41)，由中国农业科学院棉花研究所转基因课题提供&
TRV空载体大肠杆菌pYL-156,TRV阳性对照农杆菌,TRV辅助农杆菌pYL-192,CLCrV阳性对照农杆菌,CLCrV空载体大肠杆菌pCLCrVA,CLCrV 辅助农杆菌pCLCrVB等皆由转基因实验室保存&大肠杆菌D
H5a感受态细胞，农杆菌GV3101感受态细胞购自日本宝日医生物技术有限公司&
多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(RNAprep Pure Plans kii)和质粒小提试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒、限制性内切酶、Taq酶及荧光定量试剂盒(SYBR®Premia Ex Taq)购自日本宝日医生物技术有限公司，无缝克隆酶(ClonExpress®Ultra Ona Step CeoncngKct)自京维生物科限,
胶回收试剂盒购自北京普洛麦格生物技术有限公司,2-(N-‘)乙磺酸(MES)、乙酰丁香酮(AS)+ 2%基乙醇、卡那霉素、利福平等其他生化试剂购自上海生工生物工程股份有限公司&1-试验方法
1.2.1npI I基因的检测取播种1周后的CCRI 41棉花整株,CTAB法)10*提取基因组DNA作为模板，根据NCBI中公布的npt n基因序列(GenBank: AUA17992.1)，使用pymvc Premier5软件设计引物:npt I-F:CTATGACTGGGCACAACAGACAAT,npt I
R:TCGTCAAGAAGGCGATAGAAGG，的
大小为720bp。
1.2.2VIGS载体的构建以CCRI41基因组DNA 为模，使用PecmeePeemcee5软件计2个VIGS体系所需弓|物：TRVAY X a I：AAGGT-TACCGAATTCTCTAGACCGGATCAAGCGTATGCAG, TRV-R-Bam H
I：CGTGAGCTCGGTACCGGATCCAAG
ATGG ATTGCACGCAGG，扩增片段大小为350bp 左右；CLCRV YY p I：CAAAATGGCATGCCTG-CAGACTAGTCCGGATCAAGCGTATGCAG,CLCRV R-Asc I：AGACCCCGTTATTGTTACCGGGCGCGCCAA
GATGGATTGCACGCAGG，扩增片段大小为350bp 左右。使用南京诺维赞生物科技有限公司的无缝克隆酶将扩增到的目的片段与其相应的VIGS载体连接，经测序验证获得病毒重组干涉载体pYL-156-npt I和pCLCrVA-npt I。
1.2.3农杆菌的制备和侵染将得到的重组质粒pYL-156-np I和pCLCrVA-np I分别转化到农杆菌GV3101感受态细胞中(具体步骤参照说明书)。挑取阳性克隆菌落PCR检测正确后，将TRV体系中的阳性克隆菌落pYL-156-npt I与pYL-156空载体农杆菌,pYL-192辅助载体农杆菌,TRV阳性对照农杆菌菌液和CLCrV体系中的pCLCrVA-npt I阳性克 隆菌落’CLCi空载体pCLCiA农杆菌,CLCi辅助pCLCrVB农杆菌,CLCrV阳性对照农杆菌菌液，分别加入到含Kt、利福平(RO)和硫酸庆大霉素(Gen)的LB液体培养基中,28C,200r/min，摇菌8 ~10h&吸取500'上述摇好的各菌液加入到Kan、Rif、Gen的LB三抗液体培养基中，并同时加入终浓度为10mmotL的MES和终浓度为20'motL 的AS,28C,200r/min摇菌过夜。取培养好的菌液于50mL离心管中4000r/min,4C离心10min收集菌体，加入适量重悬液(无菌蒸憎水中MES1
0 mmotL,AS200mmotL,MgCl210mmol/L)充分悬浮菌体，使用Nanodrop2000C在600nm波长下调整各菌液OD600=15左右。分别将已悬好的pYL-192助载农杆和CLCeV助pCLCeVB农杆
液与其相应VIGS体系目的基因、空载体、阳性对照农杆菌悬液分别按照体积1：1混匀,25C静置3~6 h备用。
952西"#业学&34
播种陆地棉CCRI41种子,28j，光照/黑暗= 14/10h件培养7d，取子、还未
时的棉花幼苗，用器划一下子面，用的ImL注射器液从背面注入棉花子叶，使液侵染整个子叶，面达到98%上。的棉花植株避光处理12h，再次置于正常光照（28j，光照/黑暗=14/10h）培养[9]&
1.2.4表型分析与PCR检测观察2种体系TRV 和CLCrV阳性对照棉花植株叶片白化时间和表型&阳性对照白型，取白对照和np（沉默植株的，用CTAB取DNA&设计TRV 载体检测弓I物TRV-T-T1:GTGGACTTAGATTCTGTr GAGTAAGG；TRV-L-R1:ACGGATCTACTTAAAGAA CCGTAGT,PCR扩增片段大小为256bp&设计CLCaV载测弓物CLCaV-A-F1:GGGAGCTC-CACTTGGGATAGGTTAAGAA；CLCaV-A-R1:CCATC-GATGTCCCTTATTAACTTTAGGGC，PCR大小为275bp&检测2种病毒载体是侵染棉花植株&
1.2.5qRT-PCR分析取注射过npI I基因和空载体15、30+45+60+75、90d的棉，以及75和95 d的、花、组部位提取RNA&所用试剂盒为植物总RNA提取试剂盒（北京天根生化科限，参照说明）&取的RNA用荧光定录试剂盒（生物技限"进行录（参照说明），获2种的录产物cDNA。以棉花中的actin 基因为内参基因，内参引物AF：5-TTTGGCATCATr ACCTTTL，AR：5-pactggcatatagggav q设计
1M
4500bp
4000bp
2000bp
1200bp
800bp
500bp
200bp
720bp W
M：DNA Marker VII；1：CCRI41植株
M:DNA Marker VII；1：CCRI41plant
图1CCRI41中npt!基因的检测
Fig.1Detection of npt II genes in CCRI41检测npt I基因表达的特异引物np（-Q-P：5-PAC-GAGGAAGCGGTCA-3-和noG I-Q-R:5--CCTGCTT GCCGAATATC-3；对不同组样品中npt I基因表达量进行qRT-PCR检测，所用试剂为TaKaRa SYBR®Premia Ex Taq（生物限公司，具体步骤参照说明），所用仪器为Applied Biosystems 7500（Applied Biosystems，美国）。试验设置3个生物学重复和3个重复，获据采用2-计达量，使用EXCEL软件处理数据&
2结果与分析
2.1中棉所41中np I基因的检测
陆地棉CCRI41棉植株进行PCR检测，检测其基因组中是npt（基因，结果显示种植株能够npI基（图1），大为720bp，与大小一致，带单一，特异条带，说明所选CCRI41棉植株基组中npt（基&
2.22种毒载体的构建
pYLV56-npt I和pCLCrVA-npt I 2个载体分别行验，的TRV和CLCaV
沉默载体农杆行PCR扩增，分别350bp：一右的（图2），与大小一致，带单一，特异条带，表明目的载体pYL-156-np I和pCLCrVA-npt I构建成功&
2-3农杆菌侵染后棉花叶片表型及PCR检测农杆菌侵染12d，接种TRV阳照的植株叶片从顶端开始出现白化表型，空白对照植株顶端叶片颜正常野绿（图3-）。侵染23“后，
2000bp
1500bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
»350bp
M：DNA Marker D2000；1：pYL-156-p I病毒载体；2：pCLCrV-np I病毒载体
M:DNA Marker D2000；1:pYL-156-np I virus vector；2:pCLCrV vpt
I virus vector
图22种病毒沉默载体检测
Fig.2Detection of2virus silencing
vectors
5期吴洁等：不同VIIS 体系在棉花中沉默效率的研究953
CLCrV 空载体
CLCrV 阳性对照TRV 空载体 TRV 阳性对照A ：侵染12 d %TRV 体系棉花叶片的表型$B ：侵染23 d ,CLCi 体系棉花叶片表型
A : Phenotype of cotton leaves in TRV system at 12 days of infect o n ；
B : Phenotype of cotton leaves in CLCi system at 23 days of infection
图3 2个病毒沉默载体阳性对照表型
Fig. 3 2 virus silencing vector positive control phenotypes
eoa
CK 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
2000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp
250 bp 100 bp
卜 256 bp
2000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp
-> 275 bp
A : TRV 病毒载体检测%M ：DNA Marker D2000 % CK ：未侵染植株阴性对照,1〜12 ： TRV 体系npt I 沉默植株；13-24： TRV 体系空载体对照$
B ： CLCi 病毒载体检测%M ：DNA Marker D2000 , CK ：未侵染植株阴性对照,1-12： CLCO 体系npt I 沉默植株；13-24： CLCO 体系空载体对照
A : TRV virus vector detection , M : DNA Marker D2000 , CK : nevative contrcO of non-infected plant , 1 - 12 : npt I silent plants of TRV system , 13 - 24 : No-load control in TRV system ； A : CLCi virus vector detection , M : DNA Marker D2000 , CK : Nevative control of non-infected plant , 1 - 12: npt
I silent plants of CLCi system , 13 - 24 : No-load control in TRV system
图4棉花侵染植株中TRV 病毒载体和CLCr V 病毒载体检测
Fig. 4 Detection of TRV virus vector and CLCi virus vector in infective cotton
A
B
接种CLCi 阳性对照的植株出现表型变化，顶端分 生组 的幼 始 白 型， 白对照 正常未 白化表型（图3-P ）o 取2个 沉默np I 基因和空白对照棉花植株 ，提 取DNA ,PCR 扩增检测TRV 病毒载体和CLCO 病
载体是
植株并起作用，
别 256和275 bp 大的 （图4 "，与 一致，表
明2个 载 作用于棉花植株中。2.4 2
毒体系叶片中np I 基因沉默效率比较检测TRV 体系和CLCi 体系15、30 + 45、60 +75 +90 d 棉
中npt I 基因的沉默 ， 2个体系在棉花不同发育时期对目的基因沉默效率的
差异。与载 照
，农杆菌接种15 d ,
TRV 体系植株 达 抑制（图5），沉默
效率达到99.6 %，而CLCi
在农杆菌接种后
30 d ，目的基因抑
果达到最强，沉默
达到
85 %，说明TRV
CLCi
目的基因的
沉默 TRV 的沉默效果
&亍期
TRV
目的基因的沉默 逐渐 ，在 -农杆
75 90 d , 沉默
别 46 % 和 22 % ,
说明TRV 目的基因的沉默 会 棉花
植株的生长逐渐
& CLCi 体系在60 +75 +90
d
954! " #业学&
34卷
(&)*旳«甘x m *
120「
100
8060
4020
■ TRV
空载体 15
30
45
60
75 90
接种时间(d )
Inoculation time
图5 2个体系叶片中基因表达水平
Fig. 5 Expression level of npt （ gena in leavec of 2 systems
的沉默 别为84 % +82 % +77 %，说明CLCrV
载 够在棉花中持久、 的导 基因的沉
默。
2.5 2个病毒体系棉花生殖器官中npt （基因沉默
效率比较
检测2个体系75和90 d 在蕾、花、花药中npt （
基因的沉默 ， 2个 在棉 发育部
位对目的基因沉默 的差异。TRV 中 -
中的npt （基 达 的抑制（图6）,75 +
90 d 的沉默 别为12 %和11 %，而棉 其它
生殖器官发育部位基 导目的基因的沉默。
CLCrV 体系75和90 d 在蕾中对npt （基因的沉默
效率分别为63 %和61 % ，花中的沉默
别为
46 %和51 % , 中的沉默
别为38 %和33
% ，说明与TRV 载
，CLCi 载
够在棉花蕾、
花、 生殖器官发育部位诱导目的基因的沉默。
3讨论
VIGS 技术具有操作迅速、简单、成本低，使用较
的片段达 的沉默效果 够
基因沉默 型
的特点，特别适用于像棉
样的生长周期长、遗传 费 时，基因
组功能冗余的植物，
地应用于棉花基因
的研究"i*。 宇）14*
通在棉花中建立
TRV
导的基因沉默 ，抑 棉花中Gh-744XU 基因的表达，使抑
的棉花植株接种
黄
，验
Gh7A4UU 基因参与
棉 黄 的
的基 & VIGS 病
载体的
作为试验的重要步骤，决定着试验成
的 &在验证棉花中 基 的研究中,
TRV 作为 VIGS 载 ， 验 TRV
VIGS
在 棉种中的侵 果和侵染部位；使
用CLCi 作为VIGS 技术载体，研究该病毒载体在 棉花VIGS 中 和适用性[15'17]o 研究基
于2种病毒载体构建了 TRV-XIGS 和CLCrV-VIGS2
种 ，在一棉 种中验证2种 目的基因在棉 中的沉默 、 沉默时 的差异 棉
生 器官中的沉默
差异。
研究 基于TRV 载体和CLCi 病载 的 2 种 VIGS 沉默 ， 侵 棉
,TRV 体系与CLCrV
在 发育时 中
达 的 ， 明 TRV 在棉 VIGS
里是沉默 的 载体，
时 J
CLCrV
，且生长发育 沉默 逐渐 &
CLCi 体系基因沉默
TRV
，但沉
默
定、 久， 够作用于棉 植株生长发育
的整个阶段&
TRV 与CLCi 体系在不同
生殖器官中的 达量,TRV 在棉花生殖器
官中的沉默效果不明显，而CLCi
的沉
默 果， 作用于棉 、 、
部位， 明在研
uo -s saldxo
O A R E I
O H
區)*
岀烈衩旱器官
Organs
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-2
ssaldxo
O A H E I O H
區)*岀烈衩旱
器官
Organs
图6 2个体系蕾、花、花药中"ptn 基因表达水平
Fig. 6 Expression level of npt ( gena in phyla , flower and anthee of 2
systems
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