㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ｊｕｌ.２０２０ꎬ４０(７):９３５－９４３
ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１９０７０４１
张晓宁ꎬ黄宁ꎬ覃子海ꎬ等.无菌马尾松种子超低温保存技术研究[Ｊ].广西植物ꎬ２０２０ꎬ４０(７):９３５－９４３. ＺＨＡＮＧＸＮꎬＨＵＡＮＧＮꎬＱＩＮＺＨꎬｅｔａｌ.ＣｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｒｉｌｅＰｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａｓｅｅｄｓ[Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０２０ꎬ４０(７):９３５－９４３.
低温水浴
无菌马尾松种子超低温保存技术研究张晓宁１ꎬ２ꎬ黄㊀宁１ꎬ２ꎬ覃子海１ꎬ２ꎬ姚瑞玲１ꎬ２ꎬ杨㊀红３ꎬ４ꎬ刘海龙１ꎬ２∗(１.广西壮族自治区林业科学研究院ꎬ南宁５３０００２ꎻ２.广西特经济林培育与利用重点实验室ꎬ
南宁５３０００２ꎻ３.中国科学院昆明植物所ꎬ昆明６５０２０１ꎻ４.中国科学院大学ꎬ北京１０００４９)
摘㊀要：该研究利用液氮将不同含水量的无菌马尾松种子(２７.４％㊁２４.６％㊁２２.７％㊁１６.８％㊁１５.８％㊁１０.７％㊁７.５％㊁６.１％㊁４.８％㊁３.２％)进行超低温保存ꎮ结果表明:(１)在３.２％~６.１％含水量范围内ꎬ经液氮冷冻保存后的发芽率随着含水量升高而逐渐升高ꎬ在含水量６.１％时ꎬ发芽率达到最大值(９１.３３％)ꎻ当含水量大于６.１％时ꎬ发芽率逐渐下降ꎬ尤其是当含水量大于１５.８％时ꎬ发芽率迅速下降ꎻ在３.２％~７.５％含水量范围内冻存后发芽率在８０％以上ꎮ(２)冷冻㊁化冻方式影响超低温保存效果ꎮ种子无需低温预冷ꎬ直接投入液氮保存(快速冷冻)效果最好ꎻ室温空气化冻(缓慢化冻)较４２ħ水浴化冻发芽率高ꎬ且后者容易发生种皮炸裂现象ꎮ(３)种皮对马尾松种子超低温保存过程起到保护作用ꎬ使其免受机械损伤ꎬ去掉外种皮的种子冻存后发芽率显著下降ꎬ且容易出现形态不正常的幼苗ꎮ(４)超低温保存对马尾松种子萌发具有一定 刺激 作用ꎬ在最适含水量６.１％时ꎬ经超低温保存后种子的发芽率显著大于对照种子ꎮ总之ꎬ含水量㊁冷冻方法㊁化冻方法㊁种皮结构显著影响超低温保存效果ꎬ马尾松种子超低温保存的最优方法是将种子含水量控制在６.１％ꎬ直接 投入液氮快速冷冻后室温空气缓慢化冻ꎬ冻后发芽率可在９０％以上ꎮ马尾松种子超低温保存技术体系的建立ꎬ为其种质资源的长期保存提供了技术支持ꎮ
关键词：马尾松种子ꎬ超低温保存ꎬ干燥ꎬ含水量ꎬ安全含水量范围ꎬ发芽率
中图分类号:Ｑ９４５㊀㊀文献标识码:Ａ
文章编号:１０００￣３１４２(２０２０)０７￣０９３５￣０９开放科学(资源服务)标识码(ＯＳＩＤ):
ＣｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｒｉｌｅＰｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａｓｅｅｄｓ
ＺＨＡＮＧＸｉａｏｎｉｎｇ１ꎬ２ꎬＨＵＡＮＧＮｉｎｇ１ꎬ２ꎬＱＩＮＺｉｈａｉ１ꎬ２ꎬ
ＹＡＯＲｕｉｌｉｎｇ１ꎬ２ꎬＹＡＮＧＨｏｎｇ３ꎬ４ꎬＬＩＵＨａｉｌｏｎｇ１ꎬ２∗
(１.ＧｕａｎｇｘｉＦｏｒｅｓｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＮａｎｎｉｎｇ５３０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ
ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃＥｃｏｎｏｍｉｃＦｏｒｅｓｔｓꎬＮａｎｎｉｎｇ５３０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＫｕｎｍｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００４９ꎬＣｈｉｎａ)
收稿日期:２０１９－０９－１５
基金项目：国家自然科学基金(３１９６０３１１)ꎻ广西自然科学基金(２０１６ＧＸＮＳＦＢＡ３８０２２４)ꎻ广西科技计划项目(桂科ＡＤ１７１９５０７８)ꎻ广西主要用材林资源高效培育与利用人才小高地专项项目(桂财社函[２０１９]１３０)[ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ(３１９６０３１１)ꎻＧｕａｎｇｘｉＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ(２０１６ＧＸＮＳＦＢＡ３８０２２４)ꎻＧｕａｎｇｘｉＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒａｍ(１７１９５０７８)ꎻＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｕｍａｎＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＳｏｃｉａｌＳｅｃｕｒｉｔｙｏｆＧｕａｎｇｘｉＺｈｕａｎｇＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎꎬＣｈｉｎａ([２０１９]１３０)]ꎮ
作者简介：张晓宁(１９８５－)女ꎬ内蒙古乌兰察布人ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事林木种质资源离体保存技术研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｓｆｌｚｘｎ＠１６３.ｃｏｍꎮ
∗通信作者：刘海龙ꎬ博士ꎬ高级工程师ꎬ研究方向为林木遗传育种ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)５０６６９２９１＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ
Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｌｏｎｇｔｅｒｍｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＰｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａｓｅｅｄｓｔｈｒｏｕｇｈｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙꎬａｓｅｐｔｉｃｓｅｅｄｓｏｆＰ.ｍａｓｓｏｎｉａｎａｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｓ(ＷＣ)(２７.４％ꎬ２４.６％ꎬ２２.７％ꎬ１６.８％ꎬ１５.８％ꎬ１０.７％ꎬ７.５％ꎬ６.１％ꎬ４.８％ꎬ３.２％)ｗｅｒｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄｉｎｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎ.Ｏｕｒｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ:(１)ＴｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄｓｅｅｄｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｈｅｎｔｈｅｓｅｅｄＷＣｅｌｅｖａｔｅｄｆｒｏｍ３.２％ｔｏ６.１％ꎬｒｅａｃｈｉｎｇｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｒａｔｅｏｆ９１.３３％ａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍＷＣｏｆ６.１％ꎻＨｏｗｅｖｅｒꎬｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｄａｓＷＣｆｕｒｔｈｅｒｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ６.１％ｔｏ２７.４％ꎬｉｎｐａｒｔｉｃｕｌａｒꎬｗｉｔｈａｒａｐｉｄｄｅｃｌｉｎｅｉｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｅｅｄｓｗｉｔｈ１５.８％ｏｒｈｉｇｈｅｒＷＣꎻＴｈｅｒｅｉｓａｗｉｄｅｒａｎｇｅｏｆｓａｆｅＷＣꎬｗｉｔｈｉｎ３.２％－７.５％ꎬｔｈｅａｖｅｒａｇｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅｒｅａｃｈｅｄａｂｏｖｅ８０％.(２)ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｏＷＣꎬｆｒｅｅｚｉｎｇａｎｄｔｈａｗｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓａｌｓｏａｆｆｅｃｔｅｄｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ.Ｒａｐｉｄｆｒｅｅｚｉｎｇｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙｉｍｍｅｒｓｉｎｇｓｅｅｄｓｉｎｔｏｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎｉｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｐｒｅ￣ｆｒｅｅｚｉｎｇａｔ－２０ħｐｒｉｏｒｔｏｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎｆｒｅｅｚｉｎｇꎻａｓｌｏｗａｉｒ￣ｔｈａｗｉｎｇａｔｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇａｖｅａｂｅｔｔｅｒｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｃｏｍｐ
ａｒｅｄｗｉｔｈａｒａｐｉｄｔｈａｗｉｎｇｉｎａ４２ħｗａｔｅｒｂａｔｈｔｈａｔｃａｕｓｅｄｓｅｅｄｅｐｉｓｐｅｒｍｃｒａｃｋｉｎｇ.(３)Ｔｈｅｅｐｉｓｐｅｒｍａｌｓｏｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｔｅｃｔｅｄｔｈｅｓｅｅｄｓｆｒｏｍｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｃａｌｄａｍａｇｅ.Ｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅｓｗｉｔｈｏｕｔｅｐｉｓｐｅｒｍｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｗｉｔｈｅｐｉｓｐｅｒｍꎬａｎｄｔｈｅａｂｎｏｒｍａｌｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅｍｏｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｗｈｅｎｔｈｅｅｐｉｓｐｅｒｍｓｗｅｒｅｒｅｍｏｖｉｎｇ.(４)ＡｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍＷＣｏｆ６.１％ꎬｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄｓｅｅｄｓｇｅｒｍｉｎａｔｅｄｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｎｏｎ￣ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ(ｃｏｎｔｒｏｌ)ꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｍａｙｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＰ.ｍａｓｓｏｎｉａｎａ.ＣｏｌｌｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｏｕｒｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔꎬｆｒｅｅｚｉｎｇａｎｄｔｈａｗｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｅｐｉｓｐｅｒｍｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｆｅｃｔｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＰ.ｍａｓｓｏｎｉａｎａｓｅｅｄｓꎻａｎｄｔｈｅｂｅｓｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＰ.ｍａｓｓｏｎｉａｎａｓｅｅｄｓｉｓｔｏｄｉｒｅｃｔｌｙｆｒｅｅｚｅｓｅｅｄｓｗｉｔｈ６.１％ＷＣｕｓｉｎｇｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙａｓｌｏｗａｉｒ￣ｔｈａｗｉｎｇａｔｒｏｏｍｔｅ
ｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬｂｙｗｈｉｃｈｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃａｎｒｅａｃｈａｂｏｖｅ９０％.Ｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｔｈｉｓｓｔｕｄｙｍａｙｐｒｏｖｉｄｅａｒａｔｉｏｎａｌｆｏｒａｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｓｔｏｒａｇｅｏｆＰ.ｍａｓｓｏｎｉ￣ａｎａｓｅｅｄｓｔｈｒｏｕｇｈｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｐｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａｓｅｅｄｓꎬｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎꎬｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔꎬｒａｎｇｅｏｆｓａｆｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔꎬｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
㊀㊀马尾松(Ｐｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａ)为松科松属常绿高大乔木ꎬ是我国分布最广的优质乡土针叶及南方主要造林㊁绿化树种ꎬ广泛应用于用材㊁产脂㊁荒山造林及制浆造纸ꎬ在森林资源建设及生态发展中发挥着极其重要的作用(秦国峰和周志春ꎬ２０１２ꎻ杨章旗ꎬ２０１２)ꎮ广泛的地理分布和悠久的进化起源赋予马尾松种质资源丰富的遗传多样性ꎬ由于自然环境恶化及人为破坏等因素ꎬ所以其天然林在演替过程中逐渐被常绿阔叶林和人工林替代ꎬ加上单一人工林在应对病虫害及恶劣环境等自然灾害方面存在的局限性ꎬ其种质资源多样性正受到严重威胁(石娟等ꎬ２００５ꎻ邓伦秀和李茂ꎬ２００９)ꎮ因此ꎬ开展对马尾松种质资源保存的研究就显得尤为迫切和必要ꎮ种子作为植物生命的载体ꎬ蕴含着丰富的遗传信息ꎬ是遗传改良㊁品种创新和良种生产的重要物质基础ꎮ种子的离体保存能在有限的空间最大限度地保存材料的遗传多样性ꎬ且不受病虫害及天气等影响ꎬ具有成本低㊁效率高㊁交流㊁运输
方便等优点ꎬ是目前马尾松种质资源保存最主要的方式之一ꎮ
秦国峰等(２０１７ａ)研究表明马尾松种子随着保存期限的延长ꎬ其品质不断下降ꎬ常温开放保存３~４ａ几乎全部丧失发芽力ꎬ在２~４ħ低温密闭保存可在１０ａ以上ꎮ虽然低温密闭条件延长了马尾松种子的保存期限ꎬ但相比其漫长的生命周期和从发芽到产生可用于繁殖下一代种子的时间间隔仍显短暂ꎬ从保障种质资源安全的角度来看ꎬ延长其保存期限具有重要意义ꎬ而超低温保存正是目前为止实现种质资源长期保存的最佳途径ꎮ种子的超低温保存是指将种子投入到液态氮(－１９６ħ)或气态氮(－１５０ħ)条件下进行保存ꎮ在此温度下ꎬ大多数植物的种子新陈代谢活动基本停止ꎬ劣变最大限度降低ꎬ理论上可以保存成百上千年(Ｗａｌｔｅｒｓｅｔａｌ.ꎬ２００４ꎻＢａｓｕꎬ２００８)ꎬ是目前一种集简便㊁实用㊁占地少㊁低成本于一体的长期保存种质资源的方法(Ｗｉｌｄｅꎬ２０１５)ꎮ超低温保存技术已成功应用于多种木本植物成熟种子或种胚的保存ꎬ如樱桃(宋常美等ꎬ２０１９)㊁樟树(马健等ꎬ
６３９广㊀西㊀植㊀物４０卷
２０１９)㊁黑杨(Ｍａｒｃｉｎｅｔａｌ.ꎬ２０１５)㊁合欢和青杄(河英虎等ꎬ２０１３)㊁高山栲(卢玲等ꎬ２０１３)㊁红豆杉(程利红等ꎬ２０１２)ꎮ孙鸿有等(１９９４)的研究认为ꎬ马尾松种子最适保存温度是－１８~－１５ħꎮ喻
方圆等(２００６ａ)研究认为ꎬ种子在－３０ħ储藏初期
发芽率就开始大幅下降ꎮ谭俊(２００９)研究认为ꎬ
从种子的安全贮藏来看ꎬ马尾松种子不适合在－２５ħ及以下的温度贮藏ꎮ喻方圆等(２００６ｂ)利用差式扫描量热仪证明ꎬ马尾松种子在－２４.８２６ħ的温
度下结晶ꎬ细胞质中粗脂肪含量高ꎬ低聚糖与蔗糖
比值低ꎬ决定了其难形成玻璃化状态ꎬ并推测这是
马尾松种子不耐－３０ħ以下储藏的主要原因ꎮ
杨学军(２００８)首次利用脱水干燥法将马尾松
种子进行了超低温保存ꎬ当含水量为４.３％时ꎬ获
得８０％的发芽率ꎬ但主要针对含水量和冷冻保护
剂对超低温保存效果的影响进行了研究ꎮ本研究
在此基础上ꎬ以无菌种子为材料ꎬ系统研究了含水
量㊁冷冻方式㊁化冻方式及种皮的保护作用等对冻
存效果的影响ꎬ简化了马尾松种子超低温保存技
术体系ꎬ提高了保存效率ꎬ确定了最适含水量和安
全含水范围ꎬ并首次指出超低温保存对马尾松种
子具有一定 刺激 作用ꎬ进一步验证马尾松种子
超低温保存的可行性ꎮ这对马尾松种子资源长期
保存提供了理论指导和技术支撑ꎬ为其他林木种
子的超低温保存研究提供参考ꎮ本研究利用无菌
种子不仅消除了种子发霉对发芽率的干扰和影响ꎬ
而且还可直接获得无菌幼苗用于后续研究ꎮ１㊀材料与方法
１.１种子质量特性的测定及含水梯度的建立
试验用马尾松种子于２０１７年１１月采自广西
藤县ꎮ试验用干燥箱：上海施都凯ꎬＢＡＯ￣１５０Ａꎻ超
净工作台：苏州净化ＳＷ￣ＣＪ￣２Ｄꎻ光照培养箱：杭州
汇尔ＧＺＨ￣０１５８ꎻ冷冻管：美国Ｎｕｎｃꎻ硅胶：上海新
火ꎻＫＭｎＯ４：郑州中天实验仪器有限公司ꎻ：贵州省铜仁化工研究所ꎮ
参照«林木种子检验规程»(国家质量技术监
督局ꎬ２０００)要求测定千粒重㊁初始含水量和发芽
率等种子质量特性ꎮ１.１.１发芽率的测定㊀将待测种子播种于含双层滤纸的培养皿ꎬ定期喷水ꎬ保持滤纸湿润ꎮ光照培养箱２７ħ黑暗培养５ｄꎻ第６天开始ꎬ光照强度２０００ｌｘꎬ光照时间８ｈ ｄ￣１ꎮ当根长等于种子长时记为发芽ꎮ发芽率＝(发芽种子数/种子总数)ˑ１００％ꎮ４个重复ꎬ每重复１００粒ꎮ
１.１.２初始含水量(ω０)的测定㊀采用低温烘干法(１０３ħ烘干１６ｈ)测定ꎬω０＝(鲜重－绝干重)/鲜重ˑ１００％ꎮ３个重复ꎬ每重复５０ｇꎮ
１.１.３含水梯度的获取㊀消毒后的种子采用浸种和硅胶干燥的方式获取２７.４３％~３.２％的１０个含水量梯度的种子ꎬ密闭于双层铝箔袋中４ħ保存备用ꎮ实际含水量(ω１)采用减重法计算ꎬω１＝１００％－[最初重量ˑ(１００％－相对含水量)]/最后重量ꎮ(消毒方式：流水冲洗２ｈꎬ０.５％ＫＭＮＯ４浸泡０.５ｈꎬ无菌水冲洗６次ꎬ０.１％消毒５ｍｉｎꎬ无菌水冲洗６次ꎮ)
１.２种子的超低温保存试验
１.２.１不同含水量对冻存后发芽率的影响㊀先取含水量分别为３.２％㊁４.８％㊁６.１％㊁７.５％㊁１０.７％㊁１５.８％㊁１６.８％㊁２２.７％㊁２４.６％㊁２７.４％的马尾松种子装于１.８ｍＬ冷冻管中直接投入液氮保存２４ｈ后ꎬ室温自然化冻ꎬ随后将种子播于铺有三层无菌滤纸的培养皿中ꎬ封口ꎬ置于光照培养箱进行发芽试验ꎬ并测定冻存后发芽率ꎮ
１.２.２冷冻方式对冻存后发芽率的影响㊀取含水量为３.２％㊁４.８％㊁６.１％㊁１０.７％㊁１６.８％㊁２２.７％㊁２７.４％的７个梯度的种子装于冷冻管中进行如下操作:(１)快冻法：直接投入液氮ꎻ(２)缓冻法：经－２０ħ预冻３０ｍｉｎ投入液氮ꎻ(３)慢冻法：经－２０ħ低温预处理２４ｈ后投入液氮ꎮ三种冷冻方式统一在液氮保存２４ｈ后ꎬ室温自然化冻ꎬ统计发芽率ꎮ１.２.３化冻方式对冻存后发芽率的影响㊀先将上述７个含水量梯度的种子直接投入液氮ꎬ冻存后的材料从液氮中取出ꎬ设置室温空气化冻㊁４２ħ水浴化冻两种化冻方式各５ｍｉｎ后ꎬ再将种子播于铺有三层无菌滤纸的培养皿ꎬ封口ꎬ置于光照培养箱黑暗培养ꎬ记录冻存后发芽率ꎮ
１.２.４种皮对冻存后发芽率的影响㊀取含水量为２７.４％㊁１０.７％㊁６.１％和３.２％的种子ꎬ剥去种皮ꎬ装
７３９
７期张晓宁等：无菌马尾松种子超低温保存技术研究
于１.８ｍＬ冷冻管ꎬ直接投入液氮保存２４ｈꎬ室温空气化冻后ꎬ测定发芽率ꎮ
１.２.５超低温保存对种子发芽率的影响㊀取含水量为２７.４％㊁１０.７％㊁６.１％和３.２％的种子装于１.８ｍＬ冷冻管中直接投入液氮保存２４ｈꎬ室温空气化冻后置于含三层湿润滤纸的培养皿测定冻存后发芽率ꎻ对照不经液氮直接放入相同条件培养皿测定发芽率ꎮ
１.３数据分析
试验设置３个重复ꎬ每个重复１００粒种子ꎮ采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ(２０１６)软件对数据进行统计分析和绘图ꎮ试验结果为３个重复的平均值ʃ标准误ꎮ数据差异的显著性采用ＳＰＳＳ方差分析中的Ｄｕｎｃａｎ新复极差法进行估算ꎮ
２㊀结果与分析
２.１种子的质量特性及含水量梯度的建立
待测马尾松种子千粒重为１１.４８ｇꎬ含水量为９.５６％ꎬ发芽率为９０.２５％ꎮ利用浸种和硅胶干燥的方式获取含水量为２７.４％㊁２４.６％㊁２２.７％㊁１６.８％㊁１５.８％㊁１０.７％㊁７.５％㊁６.１％㊁４.８％㊁３.２％等１０个梯度的种子ꎬ用以进行超低温保存等后续研究ꎮ
２.２不同含水量对超低温保存后种子发芽率的影响１０个不同含水量梯度的马尾松种子冻存后发芽率结果如图１所示ꎮ随着含水量的下降ꎬ冻存后发芽率逐渐增高ꎬ直到含水量降为６.１％时ꎬ发芽率达到最大值９１.３３％ꎬ当继续干燥ꎬ发芽率不再上升ꎬ甚至有轻微的下降ꎬ６.１％为马尾松种子超低温保存的最适含水量ꎮ含水量为６.１％~１５.８％时ꎬ发芽率缓慢下降ꎻ当含水量大于１５.８％时ꎬ发芽率急剧下降ꎮ含水量从１５.８％增加到１６.８％时ꎬ发芽率从６９.３３％迅速下降到４５.６７％ꎮ马尾松种子适宜超低温保存的含水量范围很广ꎬ将冻后发芽率在８０％以上的含水量范围３.２％~７.５％作为马尾松种子超低温保存的安全含水量范围ꎮ
２.３不同冷冻方式对超低温保存后种子发芽率的影响不同冷冻方式对超低温保存效果的影响如图２所示ꎮ不同含水量的种子利用缓冻和慢冻法进
行超低温保存后发芽率均不同程度地低于快冻法
不同小写字母表示在０.０５水平差异显著ꎮ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０.０５ｌｅｖｅｌ.
图１㊀含水量对超低温保存后马尾松种子发芽率的影响Ｆｉｇ.１㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｏｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄｍａｓｓｏｎｐｉｎｅ
ｓｅｅｄｓ
不同小写字母表示同一含水量不同冷冻方式之间在０.０５水平差异显著ꎮ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｅｅｚｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ０.０５ｌｅｖｅｌ.
图２㊀冷冻方式对超低温保存后
马尾松种子发芽率的影响
Ｆｉｇ.２㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｒｅｅｚｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｏｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄｍａｓｓｏｎｐｉｎｅｓｅｅｄｓ
保存ꎬ结果表明将马尾松种子直接投入液氮保存效果优于先在－２０ħ预冻不同时间再投入液氮ꎮ２.４不同化冻方式对马尾松种子超低温保存后发芽率的影响
室温空气化冻和４２ħ水浴化冻对马尾松种子超低温保存效果的影响如图３所示ꎮ图３结
８３９广㊀西㊀植㊀物４０卷
果显示ꎬ室温空气化冻效果优于４２ħ水浴化冻ꎬ含水量越小ꎬ两种化冻方式的差异越明显ꎬ采用室温空气化冻后不需要回湿直接置于含湿润滤纸的培养皿进行发芽试验ꎮ另外ꎬ研究发现４２ħ水浴化冻会发生种子炸裂现象ꎬ致使种子受到机械损伤
ꎮ
∗∗和∗分别表示同一含水量不同处理之间在０.０１水平和０.０５水平差异显著ꎮ下同ꎮ∗∗ａｎｄ∗ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ０.０１ａｎｄ０.０５ｌｅｖｅｌ.Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ.
图３㊀化冻方式对超低温保存后马尾松种子发芽率的影响Ｆｉｇ.３㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈａｗｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｏｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄｍａｓｓｏｎｐｉｎｅｓｅｅｄｓ
２.５外种皮对超低温保存效果的影响
外种皮对超低温保存效果的影响如图４所示ꎬ在４个含水量梯度下ꎬ带外种皮的种子保存后发芽率显著高于去掉外种皮的种子ꎬ但去掉外种皮种子冻存后露白时间要早于带外种皮的种子１~２ｄꎬ可能是解除了种皮的机械限制作用的结果ꎮ
保留外种皮的种子胚根先突破胚乳和种皮长
出ꎬ接着下胚轴延伸ꎬ当下胚轴伸长到一定程度后ꎬ子叶初现如图５:ＡꎬＢ所示ꎬ去掉外种皮的种子发芽情况如图５:Ｃ－Ｇ所示ꎮ其中：图５:ＣꎬＤ所示为正常发育的种子ꎬ胚根先突破胚乳长出(图５:Ｃ)ꎬ后下胚轴延长㊁子叶初现(图５:Ｄ)ꎻ图５:Ｅ－Ｇ为发育顺序或幼苗形态异常的情况ꎬ子叶和下胚轴同时在种子两端生长(图５:Ｅ)ꎬ子叶和下胚轴在胚根发育相反一侧先于胚根发育(图５:Ｆ)ꎬ子叶和下胚轴在种子中间突破胚乳发育延长
(图５:Ｇ)ꎮ这种发育顺序异常或者说幼苗形态异常现象的具体原因及机理机制有待于深入研究
ꎮ
图４㊀种皮对超低温保存后马尾松种子发芽率的影响Ｆｉｇ.４㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｅｐｉｓｐｅｒｍｏｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄｍａｓｓｏｎｐｉｎｅｓｅｅｄｓ
２.６超低温保存对种子发芽率的影响
含水量为３.２％㊁６.１％㊁１０.７％㊁２７.４％的马尾松种子经超低温保存前后发芽率如图６所示ꎬ当含水量为６.１％时ꎬ经超低温保存后发芽率为９１％ꎬ显著高于该含水量下不经超低温保存的马尾松种子的发芽率８６％ꎬＰ＝０.０４９(Ｐ<０.０５)ꎮ这表明在最适含水量６.１％时ꎬ超低温保存后对种子的发芽表现出了适度的 刺激 作用ꎮ
３㊀讨论与结论
据报道ꎬ林木种子离体保存资金投入约是其树上原位保存的１％(Ｌｉ＆Ｐｒｉｔｃｈａｒｄꎬ２００９)ꎬ而作为离体保存方法之一的超低温保存ꎬ能在较小的空间较低的成本下极大地延长材料的保存时间
(Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ
'ｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎮ借助超低温保存技术ꎬ正常型林木种子的保存寿命有望延长到百年及以上(Ｗａｎｇ＆Ｓｉｍｐｓｏｎꎬ２００６)ꎮ毫无疑问ꎬ超低温保存是目前为止最经济有效的长期保存种子资源的方法ꎮ种子的超低温保存一般是将种子投入液氮一定时间(几小时至几年)取出化冻后采用ＴＴＣ染法监测材料的生活力或直接监测发芽率判断该方法的适用性ꎮ马尾松种子在液氮保存２４ｈ后化冻后发芽率为９１.３３％ꎬ本研究不仅为马尾松种子的长期保存提供了高效可行的方法ꎬ而且还为马
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３９７期张晓宁等：无菌马尾松种子超低温保存技术研究
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