细胞实验步骤
一 实验准备工作
1 材料和试剂
胎牛血清：Hyclone公司；
佛波酯（PMA）：sigma公司；
MTT：Biomol分装；
二甲基亚砜（DMSO）：sigma公司；
磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠（分析纯）： 细胞因子测定ELISA试剂盒：
硫酸铜、重铬酸钾、浓硫酸、单蒸水、三蒸水、医用酒精
2 主要仪器与设备
24、96孔细胞培养板：coning公司
多功能酶标仪
移液器
超净工作台
CO2细胞培养箱
过滤器
电子天平
恒温振荡培养箱
台式低速离心机
恒温水浴箱
冰箱（-20℃低温冰箱，-80℃超低温冰箱）
显微镜、倒置显微镜
细胞计数器
一次性培养瓶
高压灭菌锅
干燥箱
3 主要试剂配制
（1）10×PBS缓冲液：称取氯化钠80g，磷酸氢二钠28.64g，氯化钾2.25g，磷酸二氢钾2.05g于烧杯内，加入一定量的三蒸水使其溶液，最后用容量瓶定容至1L。控制其PH值在7.2-7.4之间。若出现未完全溶解，60℃水浴助溶。再过滤（0.22um微孔滤膜过滤除菌）备用。临用前稀释10倍，制成1×PBS，高压灭菌后4℃保存备用。
（2）MTT溶液：称取50mg MTT粉末放入小玻璃瓶中，加10ml 1×PBS，60℃
水浴或超声助溶，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱中避光保存，两周内有效。
清洁液（酸缸）配制：按重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml比例配制。
二 细胞培养
1．实验所需器械及其准备
1ml玻璃吸管，烧杯，培养瓶，10ml离心管，2ml、1.5ml、0.5mlEP管，冻存管、0.22 um微孔滤器，锡纸，封口膜，多孔培养板（24孔，96孔），移液器，橡胶吸头，酒精灯，75%酒精，注射器，黑塑料袋，饭盒，试管架，量筒，容量瓶等。
2. THP-1的培养
低温水浴
试剂：__0，胎牛血清(Hyclone)，佛波酯（PMA），DMSO
THP-1细胞的特性：（1）THP-1细胞是悬浮细胞；适合在偏酸的环境中生长。，但也不能让培养基的酸度太重。 （2） 一般不要频繁换液，2-3次换液离心一次（只需要中间补充培养基）。
（3）该细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上提及细胞浓度在
5*105-106个/ml，生长比较快。
（4） 一般状态不好时，培养三天后细胞数量仍然不多，
继续培养一天或两天，培养基严重泛黄，细胞数量剧增。
（5）还要注意，传代后切忌常移出培养箱观察，否则会
影响细胞生长。
（6）冻存时密度大一些，最好用血清冻存（90%的血清 +10%DMSO）。
（7）细胞密度较低时，换液后第二天细胞开始抱团，成
小或大葡萄串（“克隆体”）状生长，我自己觉得这时细胞状态还不错，待生长两三天后，细胞密度变大，自然就会成单个生长了。但是值得注意的是：当细胞密度过高时，细胞呈单个生长，部分细胞形态就会有变化，有伸出小突出的（像小伪足），可能是细胞被挤到，因此形态发生变化，换液传代后，将细胞密度调低，生长一两天，细胞形态又恢复正常了。
细胞步骤：（1）观察：肉眼观察（培养液颜，清澈度，内容物）：细胞状态好时，培养液澄清，细胞密度低时，培养基偏橙，培养液得3天左右才变黄，若细胞密度高，一两天培养液就变黄，当密度很高时，培养液有一点点混浊感，变黄，这时由于细胞过多而不是污染。这些情况下基本就可传代了。 当细胞状态不好时，培养液有混浊感，不变黄，可再观察两天，若还没有明显的变化，就丢弃。镜下（细胞大小形态，透光度，细胞膜，细胞浆，抱团现象）观察：细胞悬浮，透亮，细胞大小基本均一，也有“大个子”的细胞（细胞膜完整，不是细胞肿胀，而是处于分裂前期的细胞），或葡萄串状的，形态规则，呈圆形，细胞膜完整，胞浆清澈。细胞密度
较低时，可以见到一簇一簇的细胞，呈葡萄串状生长，此时可放到培养箱继续培养1-2天再传代。当细胞密度较高时，细胞呈单个生长，在培养液中细胞层层排列，微调显微镜，可明显看到细胞分布在培养液的每一层，此时细胞须进行传代，否则细胞密度高了会影响细胞的状态。
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