!""#年!$!月第#%卷!第&期北京师范大学学报!自然科学版"
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&国家自然科学基金重点资助项目!
#"##""A ""收稿日期#!""#@"A @$%
张雁云!郑光美!李!颖!杨!萌
!北京师范大学生命科学学院$生物多样性与生态工程教育部重点实验室$$""C D A $北京"第一作者##岁$
男$副教授"摘要!$%%%%!""#年从$D 只笼养黄腹角雉!L <=8A D =’+=G A -&"采集精液$稀释后分别保存于QX 的冰箱和Z $%&X 液氮中>在QX 条件下$保存于生理盐水&E @!液&Y ,_0液&/0-9871--0液等
不同稀释液中的精液$其精子存活状况相差很大$其中保存于/0-9871--0液中的精子存活率!)"最高$Q CT 后仍有&"^以上的活精子>在精液的冷冻保存方面$受降温过程中精子内外渗透压的变化和结晶的影响$且对于冷冻保护剂!二甲基亚砜$=K ;H "的体积分数!!"以及降温速度的选择非常重要#=K ;H 的!过高!如$"^"或过低!如$^"$都会大幅降低冷冻后精子的)$实验发现!为Q ^的=K ;H 最适于黄腹角雉精液的冷冻保存’以不同的速度降温$也显著地影响着精液的保存效果!@%">"A "> 关键词!黄腹角雉’精液’低温’保存分类号!g%A %>D ‘!A ’g$#!>$‘#
利用低温条件抑制或减弱精子细胞内的新陈代谢活动$能使精子细胞被长期保存但不失
去活性($)
>
精液的保存分为冷藏保存和冷冻保存!种方法$前者可暂时贮存精液数天>如需长期保存$则需利用冷冻保存的方法>一些国家的实验室已通过冷冻的方法$建立了一些优秀种
禽和濒危鸟类的精子库$以利于保存和传播这些物种的基因(!@#
)>
#!实验
#>#!研究对象!$%%%%!""#年对北京师范大学濒危雉类繁育中心的$D 只成年黄腹角雉!L <=8A D =’+=G A -&"的精液进行了研究>#>$!仪器和药品!冰箱$E =@#"液氮罐$自制控制台和冷冻铜筐$改装的;4!&"!数字温度计!司南仪器厂生产&改装$测量范围Z !"""A "X "$冷冻细管!世界雉类协会美国分会提供"$血球计数板$’?E 显微摄像系统$二甲基亚砜!=K ;H "
’配制以下#种稀释液#E @!液#E !碳酸氢钠"]">$A ^$E !醋酸钠"]$>"^$E !磷酸氢二钾"]">$A ^$E !葡萄糖"]$>"^$E !蔗糖"]Q >C ^$!!
醋酸"]">"!A ^$b W]D >$"D >!>Y ,_0液#E !谷氨酸钠"]">!#Q ^$E !柠檬酸钠"]">!#$^$E !氯化镁"]">"$#^$E !氯化钙"]">"$^$E !柠檬酸"]">"#%^$E !葡萄糖"]">A ^$E !肌醇"]">!!^$E !F *18"]#h D !A ^$b
W]&>%>/0-9871--0液#E !谷氨酸钠"]">C &D ^$E !醋酸钠"]">"&Q ^$E !磷酸氢二钾"]$>!D ^$E !磷酸二氢钾"]">"&A ^$E !氯化镁"]">"#Q ^$E !柠檬酸"]">"&Q ^$E !果糖"]">A "^$
青霉素!"万单位$E !链霉素"]">$^$b
W]D >!>万方数据
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北京师范大学学报!自然科学版"
第#%卷!
#>%!研究方法
#>%>#!采精方法!为改进后的腹背按摩法#将雄鸟固定在特制人工授精操作台上$用左手的拇指和食指按摩尾综骨周围$右手的拇指和食指轻轻挤压泄殖腔周围$当阴茎突露出时$左手稍用力挤压泄殖腔$右手持集精杯或细管收集精液>
#>%>$!精子计数和活力测定!精液稀释后用血球计数板测定精子密度>
为提高精子计数的准确性$利用’?E 显微摄像头将信号转到电视机上进行>采用""$的十级评分方法测定活力$按呈直线运动所占的比率给出精液的活力指标>表#!黄腹角雉精液的冷冻程序
程序步骤冷冻速率%!X &51+Z $"
降温范围%X G
$$‘A "Z !"!A "Z !""Z C "#$&"Z C ""Z $%&/
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‘A "Z #A
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#直接将装有精液的细管投入到液氮中Z $%&
E $$‘A "Z !"!Q Z !""Z A "#$"Z A ""Z C "Q
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Z C ""Z $
%&#>%>%!精液冷藏!利用国内外动物园’养殖场常用的鸟类精液稀释液$将黄腹角雉精液分别稀释于这些稀释液中$保存于Q X 条件下$定时镜检$直至精子全部死亡$筛选出适于保存黄腹角雉精液的最佳稀释液>
#>%>(!精液冷冻!将原精液和/0-9871--0液按$k #的体积比配成稀释精液$稀释后的精液直接置于AX 的
冰箱中预冷$T $分别加入=K ;H 作冷冻保护剂$细管分装$QX 条件下平衡$T $
利用表$中的#种程序进行冷冻>在AX 恒温水浴中解冻数秒$镜检>
$!结果和讨论
$>#!精液冷藏保存效果!选取#"A 岁的黄腹角雉雄鸟$采集精液并分别用生理盐水’E @!
液’Y ,_0液’/0-9871--0液等稀释液进行稀释$保存在Q X 的冰箱中$定期镜检>结果表明$
于不!图#!不同稀释液中黄腹角雉精子的存活率!
+"曲线同稀释液中保存的精液$其保存效果有很大的差异!图$">后#种稀释液的保存效果明显优于生理盐水$其中尤以/0-9871--0液的效果为好>生理盐水稀释液中的精液在前#"51+内精子的存活率!)"变化不大$$!T 后精子的)低于!"^$#&T 后精子全部死亡>而保存于/0-9871--0液中的精液$在!Q 和Q CT 后精子)仍可达D A ^和&"^以上$精子的活力也在"h A 和">Q 以上>这与在/0-9871--0液中有精子维持其正常生命活动所需的营养成分!果糖’谷氨酸钠"’抑菌成分!青霉素和链霉素"’缓冲系统!磷酸氢二钾和磷酸二氢钾"以及适宜的b W 值!
黄腹角雉原精液的b W 为D >!n ">!"等有密切关系!&"
>迄今关于鸟类精液冷藏保存的研究中$葛宝
生等(Q )在火鸡方面的实验是最成功的实验
低温水浴之一>他们发现火鸡的稀释精液在A X 条
万方数据
!第&期
张雁云等!黄腹角雉精液的低温保存
C !$!
!件下保存Q C T 后")达到了A A ^>
这略低于我们对黄腹角雉精液冷藏保存后的值>在精液的冷藏保存研究中还发现"尽管#"A 岁黄腹角雉的射精量#精子密度等参数与C
岁的个体没有明显差异$A %
"但采自#"A 岁和2C 岁黄腹角雉的精液用/0-9871--0液按体积比
$k #稀释"QX 条件下保存!Q T 后"后者的)尚未达到前者的一半>推测这可能与高龄个体精子质量的下降有关>
$>$!精液的冷冻保存效果!将黄腹角雉的鲜精液按体积比$k #稀释于/0-9871--0液中"
置于A X 保存$T 后"精液中精子的)为%">A ^>而往稀释精液中分别加入!为!^"Q ^和$"^的=K ;H 后"同样条件下保存$T ")分别为C &>#^"C $>$^和A A >Q ^>表明=K ;H 对黄腹角雉
精子的存活有一定的副作用"且随着!的增加"毒性也加大>将未加=K ;H 或加入!为$^"!^=K ;H 的稀释精液"
按表$中的程序G 冷冻"解冻后镜检"发现大量的精子破裂或溶解"只有不足$A ^的精子存活>而未加=K ;H 的冷冻精液中"解冻后几乎没有活精子>由此可见"尽管=K ;H 有一定的毒性"
但它却可在冷冻过程中起到降低精液的冰点#保护精子细胞内的谷草转氨酶&\H F ’#降低溶质浓度#保持精子细胞内外的渗透压等作用$#"&"C %
>
因此"在冷冻过程中"一定要注意选取适当!的=K ;H "过高或过低"都无法达到好的冷冻效果>筛选结果发现"!为Q ^的=K ;
H 很适于黄腹角雉精液的冷冻>冷冻过程的降温速率也非常重要>由于精子的内胞质和精子的外溶剂浓度的差异"降温过程中细胞内外水结晶的速度也不同>以较低的速率降温时"会引起细胞外水先结晶"增大溶质浓度"对精子造成渗透损伤(而以较高的速率降温"精子体内水结晶的速度超过逸出速度"最后
在精子体内形成大的冰晶"对精子造成机械损伤$&@D %
>因此必须选择适宜的降温速率"以保证解冻后活精子占有相当的比率$#"C %
>
在研究中"我们选取了国外在家禽和鹤类精液冷冻过程中效果不错的#种降温程序&见表$’进行实验>在其他条件相同的情况下"发现按这#种降温程序对黄腹角雉精液进行冷冻后"解冻后的精子的)有显著差异&@%">"A ’"依程序G 降温的效果明显比按/和E 程序降温要好"其精子的)最高可达Q #>D ^"按程序/进行冷冻后"解冻后的精液中活精子非常少"部分样本中几乎没有活的精子&见表!’>尽管各程序冷冻后的)相差很大"但死精子的形态却很相似"一般出现质膜破裂和分离#顶体脱落等现象>这与渗透损伤#细胞内结晶等有关"如何尽可能减轻这一影响"也是动物精液冷冻保存研究者所要进一步解决的
共同问题$Q %
>
表$!不同降温程序对精子冷冻效果的影响
降温程序G /E )
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!!按照
G 程序冷冻"黄腹角雉精液解冻后)达到了
#A ^"
这一结果达到了国内外在其他鸟类的研究水平!
张玲等$%%
利用解冻后精子)
在!A ^以上的精液为雌性白枕鹤&M <0#I &D
&A ’输精"受精率为A "^(W ,*9-0：等$$"%对波斑鸨&C >B =$;
"A -�’"0B =-=’的精液冷冻研究"冷冻后精子的)为&#&>Q Q n $&>$D ’^"人工输精后受精率达到$""^>
%!参考文献
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##$!李喜龙%季维智>动物种质细胞的超低温冷冻保存#’$>动物学研究%!"""%!$!A"&Q"D
#Q$!葛宝生%刘健>不同保存方法对火鸡精子超微结构和受精率的影响#’$>兽医大学学报%$%%"%$"!!"& $%"
#A$!张雁云%郑光美%常崇艳%等>黄腹角雉!L<=8A D=’+=G A-&"的人工授精研究#’$>北京师范大学学报!自然科学版">!""!%#C!$"&$$D
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