可靠性。
5 参考文献
[1]郑家齐，产编.医学检验质量控制.北京：人民卫生出版社,1998186-871
(收稿:2002-12-03)
(本文编辑：张军)
邱波1，姚斐2，姚怡1，纪伟尚2
(11山东省青岛市疾病控制中心,266033;21青岛海洋大学生命学院)
关键词 致病弧菌；低温；菌种保存
中国图书资料分类号:R44615 文献标识码:B 文章编号:1004-1257(2003)09-0053-02
致病弧菌是人和水产动物的常见病原菌。其中，比较常见的有弧菌、副溶血弧菌等。由于对人的健
康和水产动物危害严重，有关研究也越来越多。病原学研究必然用到菌种，菌种的保藏是这些工作不可分割的一部分。菌种保藏有多种方法，但对于基层实验室来说，比较普遍的方法是接种半固体或营养琼脂斜面后，放4～6℃冰箱保存。但用这种方法保存弧菌，在较短时间，用常规方法即检测不到[1,2]，通常认为已经死亡。近年来研究发现，弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌等细菌，在低温水中能变成另1种存活形式即活的非可培养状态，处于这种状态的细菌用常规方法检测不生长，但仍然存活[2-5]。保存在低温下的菌种，能否变为这种形式尚未见报告。为探讨弧菌、副溶血弧菌菌种在低温下的变化规律，我们用不同温度进行了比较研究。 1 材料与方法
111 试验菌株 01弧菌、非01弧菌和副溶血弧菌各1株。
112 保存和观察方法 菌株用营养琼脂平板传代2次后，接种营养琼脂斜面,37℃培养过夜，用胶塞塞紧，分别放4～6℃冰箱、15℃生化箱和室温保存。定期用营养琼脂平板检查存活情况，同时做革兰染，观察染和形态。当平板上菌落很少时，每天检测。当无菌落生长时，则接种碱性蛋白胨水(1%NaCl), 37℃培养18～24h，然后接种营养琼脂平板。如连续2次检测阴性，即参照DVC法(direct viable count)检测[3]。弧菌和副溶血弧菌鉴定分别参照《防治手册(第五版)》和文献[6]进行。01诊断血清购自中国药品生物制品检定所，所用培养基购自山东省卫生防疫站。
113 DVC法 将细菌刮下，用灭菌生理盐水(经孔径012μm的滤膜过滤)混悬，取10ml放于小三角瓶中，加入终浓度为01001%的奈啶酮酸和01025%的酵母膏(S igma公司生产),37℃培养过夜。吖啶橙染后，用落射荧光显微镜观察[3]。
114 毒力测定 将不同阶段分离的菌株，接种碱性蛋白胨水(1%NaCl)后，按文献[6]进行，同时用原菌种做对照。
2 结果
211 菌种在不同温度下的变化 在4～6℃,01弧菌和副溶血弧菌在第16周时，直接分离平板不生长。但增菌后用营养琼脂平板能够检出，但分别在12d和8d后再未检出。非01弧菌在第18周时直接分离平板不生长，增菌后检出16 d，之后检测不到。常规方法检出的时间，见表1。
表1 4～6℃常规方法各菌种检出时间(d)
O1弧菌非O1弧菌副溶血弧菌
直接分离法110122106
增菌法12168
合计122138114
3个菌种起初都为正常菌体形态，后逐渐变为不典型。从第4周起，不但在培养基上形成的菌落数逐渐减少，而且菌落逐渐变为大小不均，部分形态不典型。至后期出现少量的小菌落，失去典型特征。在菌落减少同时，出现正常菌体逐渐变成缩小的杆状、卵圆型和圆球型菌体，且逐渐变多，至第8周时，圆球型菌体明显增多。用常规方法检测不出时，几乎全部变成圆球型。这些杆状、卵圆型、圆球型菌体仍为革兰阴性，但染时不易着。变态的弧菌与抗血清凝集良好。
在室温和15℃保存的菌种，从第7个月始，出现少量的变长、变粗的菌体12个月时常规检测仍有大量菌落出现，染未见改变。
212 菌株生化和毒力 菌株生化和对小白鼠致死力分别与原菌株相同。但常规方法不生长的细菌，生化反应无法测定，其悬液不能使小白鼠致死。
213 荧光染结果 处于不可培养阶段的菌体较正常菌体明显缩小，为圆球型，发绿荧光，与正常菌体颜相同。加入奈啶酮酸和酵母膏培养后，未见变大。新鲜的弧菌为弧状，副溶血弧菌菌体为多形性。
3 讨论
研究表明,4～6℃保存的菌种用常规方法检出的时间仅为4个月，而室温和15℃保存的菌种则在1a以上。在4～6℃，菌体逐渐变成较正常菌体明显缩小的杆状、卵圆型，最终变为圆球型，而在15℃和室温的菌种不是这样。玻片凝集证明，常规方法检测不生长的弧菌仍有很好的抗原性，但对小白鼠没有致死力。Xu和Jiang等人研究发现，在4～6℃自来水中的弧菌和人工海水中的副溶血弧菌不繁殖，平板培养计数逐渐减少，过很短的时间即检测不到。吖啶橙染计数发现细菌总数没有变化，但随着时间延长，菌体从正常形态逐渐变为缩小的圆球型。DVC法检测发现这些细菌不但变大，而且数量基本处于同一水平，说明这些细菌仍然存活(活的非可培养状态)。我们首次对低温保存的弧菌菌种进行了研究，虽未弄清这些圆球型的细菌是否存活，但发现细菌形态改变和数量的变化趋势与上述结果完全符合[3,5]。因此，初步揭示了这些菌种在冰箱中存放一段时间后，常规培养方法检测不生长的原因是变成了圆
球型。因此，用营养琼脂斜面保存弧菌和副溶血弧菌菌种不应放冰箱，最好放在15℃以上。
4 参考文献
[1]谢正阳，蔡燕刚，吴艳芳1弧菌的简易和长期保藏法的研究1微
生物学通报,1986,13(4):174-1771
[2]许兵，徐怀恕，纪伟尚1一种新发现的细菌的特殊存活形式一活的非
可培养状态1中国微生态杂志,1990,92(3):60-641
[3]Xu HS,R obert NC,Adams LB,et al.Survival and viability of nonculturable
Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment.
M icrobiol Ecol,1982,8:3131
[4]许兵，徐怀恕，纪伟尚1弧菌活的非可培养状态的回复研究1青
岛海洋大学学报,1994,24(2):183-1941
[5]Jiang X p,Chai T J.Survival of Vibrio parahaem olyticus at low tem peratures un2
der starvation conditions and subsequent resuscitation of viable,nonculturable cells.Appl Environ M icrobiol,1996,62:1300-13051
[6]中华人民共和国卫生部1中华人民共和国国家标准1食品微生物学
部分1北京：中国标准出版社,1995136-381
(收稿:2002-01-16)
(本文编辑：张军)
代金平
(河南省安阳市中心血站,455000)
关键词 单采血小板；冰冻保存；质量控制
中国图书资料分类号:R446111 文献标识码:B 文章编号:1004-1257(2003)09-0054-01
随着医学事业的发展和医务人员对科学输血知识认识的不断提高，血小板在临床中的应用量越来越大，包括性输注和预防性输注。由于普通血小板保存期短，采集和检验需一定时间，已不能满足临床的需求。由于冰冻保存的血小板具有良好的临床止血效果和可长期保存的优点，所以冰冻血小板需求量越来越大。因为冰冻血小板的临床止血效果与所输注的血小板数量和质量密切相关，因此，单采血小板从采集到冰冻保存直至输注给病人其质量控制就显得尤为重要。
1 单采血小板的质量控制
111 捐献血小板者身体健康要求 捐献血小板者，年龄最好在18～45岁之间，以男性为主，体重应大于50kg。捐献前应符合《献血者健康检查标准》。且外周血血小板计数≥150×109/L, Hb≥110g/L，红细胞压积在0135以上。献血小板者间隔1个月以上，近3个月未献过全血，上肢静脉充盈良好。
捐献血小板者前1周未服阿司匹林、消炎痛，布洛芬等影响血小板功能的药物；前1d未吃高脂食品，当日不空腹。
112 采集前先给捐献者口服10ml葡萄糖酸钙1支。作好穿刺部位的清洁消毒。我站采用CS-3000plus血细胞分离机设备，设定分离夹T NX-6，收集夹A-35,1min血流量50ml，转速1600r/min,I DO值为8，全血与枸橼酸-枸橼酸盐(AC D)配方抗凝剂比率为11∶1。采集过程中密切观察捐献者，并与其交谈，消除其思想紧张情绪。减少红细胞和白细胞混入量。每袋采集血小板计数应≥215×1011/袋。采集时间过长、采集过程不顺利、血小板量不足、及有红染现象等情况不得用于制备冰冻血小板。我站单采血小板经质控监测结果，见表1。
表1 76袋单采血小板质量监测结果
袋数
pH
实测值不合格袋数
红细胞(×109袋)
实测值不合格袋数
白细胞(×108袋)
实测值不合格袋数
血小板(×1011袋)
实测值不合格袋数
76 6.0～7.100.001～1.67900.001～2.40 1.6～3.12注：实测值为最小值和最大值，卫生部标准:pH612～7.4。混入红细胞≤8×109/袋，混入白细胞≤5.0×108/袋，血小板含量≥2.5×1011/袋[1]。
从表1可以看，严把捐献者体检关，严格操作规程，可以获得合格的机采血小板。其中有2袋血小板计数不足215×1011/袋，分析原因是由于捐献者精神紧张造成采集过程不顺利造成的。
2 冰冻血小板制备过程质量控制
211 添加二甲基亚砜(DMS O)的质量控制 单采血小板采集后，放在22℃环境条件下1h。测算血小板容积，计算所需二甲基亚砜的量。添加二甲基亚砜时，在百级净化间内的净化台上进行，严格无菌操作技术，防止细菌污染。添加二甲基亚砜的时间不少于5min，缓慢加入使二甲基亚砜最终浓度达到5%，添加二甲基亚砜过程中，要使其和血小板充分混匀，防止局部产热，出现似纤维蛋白状析出物。不得用手挤捏血小板盛放袋[2]。212 迅速封口低温保存 添加二甲基亚砜结束后，立即热合封口，热合处应在开口前端。检查外观是否呈均匀悬浊液，查实合格后，立即置于纸盒内，平放于-80℃深低温冰箱内贮存备用。3 冰冻血小板解冻及输注前质量控制
冰冻血小板从-80℃冰箱取出后，要在38～42℃循环式水浴箱内快速解冻，使其完全溶解。温度一定要控制好，不可过高或过低。使用温度计测试水温。低温水浴
解冻后，应尽快输注，不可在室温下放置过久，以防血小板功能部分丧失。故解冻过程最好在医疗机构进行，以缩短由解冻到输注之间的时间，保证血小板的临床止血效果。
4 参考文献
[1]G B18469-20011全血及成分血质量要求.
[2]王培华，主编1输血技术学1北京：人民卫生出版社,1998167-701
(收稿:2002-12-12)
(本文编辑：张军)
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