第10章 超低温植物种质保存——离体植物器官、组织和细胞的超低温冰冻保存技术. 种质保存的常见形式:
种子保存;
种植保存;
超低温冷冻保存。
第1节 抑制外植体生长的离体保存方法
1 降温
2 降氧
3 使用生长延缓剂
4 其他
第2节 超低温冰冻保存技术
1 原理 在液氮(-196oC)的超低温条件下,细胞的整个代谢和生长活动完全停止.在组织和细胞的超低温储存过程中, 不会发生遗传性状的变异,也不会丧失形态发生的潜能.
主要仪器设备
用于组织和细胞培养的全套设备；
普通电冰箱；
低温冰箱；
程序降温器；
液氮罐；
显微镜；
分光光度计；
… …
2 材料的准备和预处理
2.1材料的选择
生理状态；大小；培养阶段；取材季节；……
2.2 预培养和预低温处理
预培养：培养基中加入一些能使抗寒力提高的物质,可以提高培养细胞的抗冰冻能力.低温水浴
低温预处理：将选好的细胞等材料放在低温下锻炼数天，可能大大提高液氮保存的存活率.
1）冰冻保护剂（冷冻保护剂，抗冻剂）
常用：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、糖类(山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖等)、脯氨酸等.
冷冻保护剂使用的浓度和种类因植物种类不同而异.对许多植物来说,DMSO最佳.
DMSO对于培养细胞的适宜浓度是5~8%.
2) 保护剂预处理：
保护剂配制：可以溶解在培养基里,也可溶解在有糖或无糖的水中
使用：为避免对细胞的渗透冲击，加保护剂应慢。由于DMSO等有毒，冰冻保护剂预处理时必须在0oC下进行，时间一般不超过1h。
许多情况下,几种保护剂混合使用可以减低药剂的毒性,提高细胞的存活率。可能原因：
A、彼此减小甚至消除单一成分的毒害作用;
B、使各种成分的保护作用得到综合协调的发展。
3 降温冰冻基本操作
3.1 慢冻法
在有冰冻保护剂存在的条件下,慢速降温。通过细胞外结冰,使细胞脱水,直到细胞质的冷冻点.然后转到液氮中.
适于不抗寒的植物，及悬浮培养的细胞等。
3.2 快冻法
一般是将材料经低温预处理后直接投入液氮.
利用超速冷冻使细胞内的水迅速通过冰晶生长的危险温度区。
脱水程度较高的材料常用此法，如种子、花粉、冬芽等.
3.3 两步冰冻法 (预冻法；逐步冷冻法 )
将快冻法和慢冻法结合使用。第一步用慢冻降到
-20 ~ -50oC（-30 ~ -40oC），使细胞达到适当的保护性脱水；然后第二步再投入液氮中速冻.
对茎尖、芽等的效果较好，悬浮培养的细胞和愈伤组织也可用此法得到较好的效果。
3.4 包埋-脱水法
将含有材料的褐藻酸盐溶液滴向高钙溶液，固化成的球状颗粒在高渗培养基上培养数h至数d，再经部分脱水后，直接投入液氮。
3.5 干冻法(dry-freezing method;干燥冷冻法)
将材料放在一定条件下使其脱水,可以提高其对冰冻损害的抵抗力.
3.6 玻璃化法
材料经较高浓度的复合保护剂（玻璃化液）处理后，直接放入液氮中贮存。
玻璃化冰冻保护剂目前常用的有PVS2：30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4mol/L蔗糖的MS-NH4+无激素培养基。
可和包埋法结合使用.
4 化冻操作
4.1快速化冻,即在35~40oC温水中化冻;
大多数材料(包括玻璃化冻存的材料 )都采用快速化冻法.
4.2 慢速化冻,在0oC、2~3oC或室温下进行化冻.
有些木本植物的冬芽需在0oC左右低温下进行慢速化冻才能得到较好结果.
一但冰化完后,应立即将装材料的试管移到温水浴中,并立即迅速进行洗涤和再培养.
光照对恢复生长也有影响。超低温保存材料恢复生长初期，在黑暗或弱光下培养多数效果较理想。
解冻后的材料一般都需要洗涤，但某些材料不经洗涤直接投入固体培养基，数天后即恢复生长，洗涤反而不利。
5 化冻材料的活力检测
5.1 再培养
5.2 活体染料染
二醋酸酯荧光素(FDA)
中性红等活体染料
TTC(氯化三苯四氮唑还原法)
5.3 其他
细胞结构的变化
生化反应的变化
遗传特性是否保持等
6 超低温种质保存实例
6.1 茎尖的超低温保存——豌豆茎尖分生组织的超低温保存
基本过程：
种子消毒无菌播种
切取茎尖预培养
培养瓶降温转至液体培养基
加保护剂
慢速降温
液氮保藏
迅速化冻
再培养
6.2 培养细胞——水稻和甘蔗悬浮培养细胞和愈伤组织的超低温保存
收集培养一周的悬浮培养细胞或培养2周的愈伤组织于试管中
盛有材料的试管插入冰浴中,加入0oC预冷的冰冻保护剂，0oC放置10min.
每分钟降3oC的速度降到-4oC, 冰粉接种冰晶中心
以每分钟降低1oC的速度降温到-30oC,然后浸入液氮
储存一定时间后,取出材料在40oC温水中迅速化冻,化冻后立即转移到20oC水浴中
用含3%蔗糖的液体培养基洗涤3~4次
将洗涤后的细胞组织转移到新鲜培养基上进行再培养，并用TTC法测定生活力。
甘蔗愈伤组织分化再生出植株（存活率达60%以上）.
6.3 柑桔茎尖的玻璃化法超低温保存
材料:枳壳、红肉脐橙、瓯柑等品种。
将长度约为10mm的不同品种的柑桔茎尖于5%DMSO+5%蔗糖+MT基本培养基上预培养3d.
切取2～2.5mm长的茎尖，室温下用60% PVS2处理20~30min，然后用PVS2于0oC处理50~60min，换入新鲜的PVS2，迅速投入液氮中。
液氮保存24h后，取出冷冻管，在40oC水浴中迅速化冻，再用1.2mol/L蔗糖培养基洗涤2次。
枳壳茎尖经TTC法检测，成活率为100%；接种于含BA 1.0mg/L的MT培养基上，26oC暗培养1周后转于正常光照下培养，再生率达到90%，再生苗能正常生根，且与对照无形态上的差异，移栽可成活。
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