马铃薯（Solanum tuberosum L.）茎尖超低温保存及遗传稳定性鉴定 马铃薯(Solanum tuberosum L.)是全球第四大农作物。中国是全球马铃薯第一生产大国。
种质资源的保存是马铃薯新品种选育的前提条件。超低温保存被认为是迄今为止最理想的长期稳定保存种质资源的一种方法。
马铃薯种质资源的超低温保存在国际上已有大量研究。在国际马铃薯中心(秘鲁)、德国国家种质资源与育种中心、韩国等已建马铃薯超低温基因库。
但是，中国对于马铃薯种质资源超低温保存的研究极少。因此本研究目的在于建立2种广谱、有效的马铃薯种质资源超低温保存技术，并应用分子标记技术（ISSR和AFLP）鉴定超低温保存后再生植株的遗传稳定性。 为中国建立马铃薯种质资源超低温基因库提供技术支撑。本实验以中国马铃薯品种“紫花白”试管苗为材料，通过优化影响超低温保存茎尖成活率和再生率的关键因素，成功地建立了玻璃化法和包埋-玻璃化法。
玻璃化法技术要点是：从3周苗龄试管苗取茎段(0.5cm)，在Murashige and Skoog (1962, MS)培养基上培养10天，取1-2mm大小的茎尖在含有0.45M蔗糖的MS培养基上预培养1天。预培养后的茎尖分别用60%和80%的植物玻璃化液(Plant vitrification solution2, PVS2)在00C下处理30分钟，然后在100%PVS2，00C下处理40分钟，转到冷冻管中直接投入液氮中保存1个小时。
超低温保存后的茎尖在380C水浴解冻2分钟后，室温条件下用含有1.2M蔗糖的MS溶液卸载20分钟，转入成活培养基(Survival medium, SM)上暗培养三天，再转入再生培养基上，在光照条件下再生成苗。玻璃化法超低温保存茎尖的成活率和再生率分别为90.5%和41.5%。
包埋-玻璃化法技术要点：从3周苗龄试管苗取茎段(0.5cm)在MS培养基上培养7天，取1-2mm大小的茎尖在含有0.3M蔗糖的MS培养1天。将茎尖转入含有2.5%硅藻酸钠和0.4M蔗糖包埋液中，在含有0.1MCaCl2和0.4M蔗糖的MS溶液中形成直径约4-5mm的小球。
将小球转入含有0.6M蔗糖和2M甘油的加载液中加载处理90分钟（70rpm摇床）。将小球转入PVS2中，00C下，摇床上(70rpm)脱水5小时。
低温水浴
将冷冻管直接投入液氮中冻存1个小时。超低温保存后，茎尖在380C水浴锅中解冻2分钟，然后用1.2M蔗糖的MS溶液室温下卸载20分钟，转到SM上培养暗培养3天。
再转入再生培养基中在光照条件下成苗。包埋-超低温保存茎尖的成活率和再生率分别为90.2%和72.5%。
通过测试小滴-玻璃化法、玻璃化法和包埋-玻璃化法对中国9个马铃薯主栽品种的成活率和再生率的效应发现，小滴-玻璃化法的最高成活率和再生率为92.5%和92.5%，玻璃化法为78.0%和45.0%，包埋-玻璃化法为95.1%和72.5%。8个品种的平均成活率和再生率为：小滴-玻璃化法最高（93.9%和64.9%），而玻璃化法最低（81.5%和44.1%）。
利用ISSR和AFLP分子标记技术对小滴-玻璃化法、玻璃化法和包埋-玻璃化法超低温保存后获得的再生植株进行了遗传稳定性鉴定。在ISSR分子标记中，从30个引物中筛选出10个引物，对对照30株和超低温保存后的90株再生植株的鉴定结果表明，每个引物均能获得4条以上的扩增条带，共获得7440扩增条带，与对照母株比较，没有发现特异性条带。
在AFLP分子标记中，从20对不同的引物组合中筛选出6对引物组合，6对引物组合对对照3
0株和超低温保存后的90株再生植株的鉴定结果表明，每个引物组合均能获得29条以上的扩增条带，共获得24360扩增条带，与对照母株比较，也未没有发现特异性条带。ISSR和AFLP的鉴定结果表明，3种不同的超低温保存技术获得的再生植株是遗传稳定的。
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