作者单位：100029北京首都医科大学附属北京安贞医院-北京市
周玉杰
葛海龙
方哲
韩
红亚
高霏
王建龙）；王静现在北京丰台医院急诊科
通信作者：周玉杰，
E-mail ：azzyj12@163．com DOI ：10．3969/j．issn．1007-5062．2011．03．018
·
基础研究·
王静
周玉杰
葛海龙
方哲
韩红亚
高霏
王建龙
〔摘要〕目的：结扎小型猪冠状动脉左前降支（left anterior descending ，LAD ）建立急性心肌梗死
（a-cute myocardial infarction ，AMI ）模型，评价和探讨单硝酸异山梨酯类制剂对AMI 后血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF ）表达的影响。方法：中华小型猪48只，全麻下开胸结扎LAD 远段，建立急性心肌梗死（AMI ）模型，术后随机分为实验组（24只）和对照组（24只），实验组口服长效硝酸酯类制剂（异乐定缓释胶囊，50mg /d ），对照组口服安慰剂，分别于服药后2w 、4w 、6w 和8w 取梗死区周围心肌组织标本，采用Western Blotting 法及Realtime PCR 法分别检测不同时间2组梗死区周围心肌组织VEGF 表达水平。结果：与对照组相比， 在4w 、6w ，实验组梗死区周围心肌组织VEGF 表达水平均显著高于对照组［
（1819.0ʃ408.4）vs．（1247.5ʃ356.8）；（2054.4ʃ380.3）vs．（1937.5ʃ506.2），P ＜0.05］。结论：单硝酸异山梨酯类制剂能改善小型猪急性心肌梗死后，梗死区周围心肌组织VEGF 表达水平，且以4w 、
6w 时最为显著。〔关键词〕心肌梗死；血管内皮生长因子；动物实验，猪〔中图分类号〕R 54
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1007-5062（2011）03-246-03
The effect of isosorbide mononitratenitrate S．R．capsules on the expression of vascular endothelia
l growth factor in acute infarcted myocardium WANG Jing ，ZHOU Yujie ，GE Hailong ，FANG Zhe ，HAN Hongya ，
GAO Fei ，WANG Jianlong
Department of Cardiology ，Capital Medical University Affiliated Beijing Anzhen Hospi-
tal Beijing Istitute of Heart ，Lung and Blood Vessel Disease ，Beijing 100029，China
［Abstract ］Objective ：To study the effect of isosorbide mononitratenitrate S．R．capsules on the expression of vascular endothelial growth factor in acute infarcted myocardium．Methods ：Acute myocardial infarction was es-tablished through clipping left anterior descending （LAD ）vessel of swine．After coronary artery was clipped ，48swines were randomized into 2groups ，one is therapeutic group ，which fed 50mg isosorbide mononitratenitrate S．R．capsule daily ，the other is control group．Every 6swines in each group was evaluated at the 2nd week ，the 4th week ，the 6th week and the 8th week after surgery respectively．The endpoints of this study include the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF ）which evaluated by Western Blotting and Realtime PCR．Results ：In therapeutic group ，The VEGF expressed more in the therapeutic group on the 4th and 6th week ［（1819.0ʃ408.4）vs．（1247.5ʃ356.8）；（2054.4ʃ380.3）vs．（
1937.5ʃ506.2），P ＜0.05］．Conclusion ：The VEGF expression is more in the therapeutic group than control groups on the 4th and 6th week．
［Key words ］Myocardial infarction ；Vascular endothelial growth factor ；Animal laboratory ，pig
硝酸酯类药物是心血管领域中应用较早和较广泛的药物，具有上百年的应用历史。其中（nitroglycerin ）、硝酸异山梨酯（isosorbide dinitrate ）
和单硝酸异山梨酯（isosorbidemo nonitrate ）在临床上
常用于冠心病、充血性心力衰竭（心衰）等疾病
十字花封控［1］
。是使用最广泛的抗心绞痛药物之一。其中，
长效硝酸酯类药物由于特殊的药代动力学效应，近年来成为临床上引起广泛关注的药物。
本研究观察单硝酸异山梨酯类制剂（口服给药）对冠状动脉结扎小型猪心肌梗死区血管生成及
血管内皮生长因子的影响。
材料与方法
实验动物：健康成年中华小型猪48只，雌雄不
论，平均体质量（23.72士4.03）kg ，由中国农业大学北京房山区琉璃河实验动物养殖中心提供。所有实验动物的饲养均在解放军总院实验动物中心进行。饲养采用一猪一笼饲养，以防相互噬咬。
动物模型制作：小型猪取右侧卧位固定于手术台上，气管插管后机械通气。常规消毒铺巾，手术从胸壁左侧第四肋间切口（指腹触及心脏搏动最强处）进胸，暴露心包，从左心耳部打开心包腔约5cm ，暴露心脏。向上翻起左心耳，沿左心耳根部顺左前降支（LAD ）走行方向到LAD 第二对角支起始部，以2根丝线牵引对角支血管，提起后迅速使用冠状动脉阻断带，用力夹闭阻断带，待心脏左心室前壁逐渐变为暗红、运动幅度降低后，结扎LAD （图1），确定无活动出血后，排气关胸。术后连续3d 予以青霉素320万u ，肌注，预防感染
。
图1冠状动脉结扎LAD
试剂与仪器：单硝酸异山梨酯缓释胶囊（商品名：异乐定）为珠海许瓦兹制药有限公司生产并提供，国药准字H20031224，规格50mg /粒，生产批号609041。betal
主要试剂：Trizol 试剂盒：购自Invitrogen 公司，PCR 引物：北京博迈德科技发展有限公司，AMV 反转录试剂盒：购自Takara 公司，
Real-time PCR 扩增试剂盒：购自北京泽平生物技术有限公司，Agarose ：购自Promega 公司，
DEPC ：购自Sigma 公司，100bp DNA Ladder ：购自北京全式金生物技术有限公司，计算机图像分析仪：Image-Pro Plus Analysis Soft ware 。试验方法：自液氮贮存罐中转移出组织块，置入经冰预冷的研钵中。进行组织总RNA 提取，实时定量（real time ）PCR 方法进行VEGF 靶基因的定量研究。
Western-blotting 测定方法
主要实验仪器试
表1VEGF mRNA 引物
引物序列
探针
PCR 产物
VEGF 正向引物5'-ACGAAGGTCTGGAGTGTGTG-3'
119bp VEGF 反向引物5'-TGCATTCACATTTGTTGTGC-3'β-actin （内参）正向引物
5'-TCTGGCACCACACCTTCT-3'114bp
β-actin （内参）反向引物
5'-TGATCTGGGTCATCTTCTCAC-3'
剂：计算机图像分析仪，
Image-Pro Plus AnalysisSoft ware ，4ħ低温高速离心机（Thermo 公司，美国），一抗VEGF 为小鼠单克隆抗体（美国abcam 公司，货号：ab68334，批号：826205），二抗为辣根酶标记山羊抗小鼠IgG （北京中杉金桥公司）。
组织蛋白提取及蛋白定量：将组织加入细胞裂解液离心10min ，用Bradford 法测定上清蛋白含量后，移至另一预冷的EP 管中，沉淀弃之，将剩余蛋白样品加入等体积的2ˑSDS 上样缓冲液，沸水中煮5min 。制胶及上样：配制12%SDS-PAGE 分离胶溶液，插入加样梳，缓缓加入5%浓缩胶，室温下静置。垂直固定于凝胶电泳仪上，分别取80μg 蛋白量的组织总蛋白样品及蛋白质分子量Marker ，加入缓冲液，使蛋白变性。将处理好的样品按照预定的顺序加入浓缩胶的上 样孔内，
进行电泳。抗原抗体反应及显影后，用IPP 软件对扫描图
象的目的条带进行灰度分析及蛋白图像分析。统计学分析采用SPSS 16.0分析系统，计量资料用均数ʃ标准差表示，各组数据组内及组间采用t 检验进行统计学处理，P ＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1.VEGF 基因片段的Real-time PCR 结果：在2
w 、4w 时，实验组与对照组相比较，目的基因VEGF 的CT 值与内参GAPDH 的CT 值相对表达量二者比财务报销管理系统
较差异有统计学意义（表2）。2w 、4w 时VEGF 的生成，实验组高于对照组。
表2
2组动物VEGF 基因mRNA 表达的比较（珋
x ʃs ）组别2w
4w
6w
8w 实验组 1.25ʃ0．84 1.50ʃ0．76* 1.78ʃ0．58* 1.83ʃ0．78对照组
0.94ʃ0．57 1.10ʃ0．83* 1.50ʃ0．64* 1.79ʃ0．98P 值
0.5790.0430.036
0.625
注：2组比较，
*
P ＜0.052.2组动物VEGF 蛋白表达的比较：经冠状动
脉结扎后，不同组别及同一组别，不同观察时间，心肌细胞中VEGF 表达的观察（表3）：AMI 模型不同时段VEGF 的表达：对照组VEGF 表达灰度值从第2
w 起至第8w 持续上升，实验组各时间点的趋势与
对照组一致，且第4w 、第6w VEGF 的表达与对照组相应时间点差异有统计学意义（P ＜0.05），第8w 2组差异无统计学意义（P =0.146）。
表3
2组动物VEGF 表达灰度值
组别
2w
4w
6w
8w 实验组1398.5ʃ335．81819.0ʃ408．42054.4ʃ380．3
2148.4ʃ359．6对照组1060.7ʃ467．81247.5ʃ356．81937.5ʃ506．22023.6ʃ382．4
P 值
0.245
乘波体0.043
0.034
0.146
根据IPP 软件对扫描图象的目的条带进行蛋白图像分析（图2），观察初始阶段，对照组1与试验组1相比，二者蛋白灰度颜无明显差异；随着观察时
间的延长，
与对照组2相比，实验组2的蛋白灰度条带颜显著；试验组3蛋白灰度颜较对照组3显
著。但是在观察终点，试验组4与对照组4相比，二者蛋白灰度颜差异不显著。这与VEGF 表达灰度值所得出的结论相一致
。
A 、
B 、
C 、
D 分别为对照组2w 、4w 、6w 、8w
E 、
F 、
G 、水下呼吸器
H 分别为实验组2w 、4w 、6w 、8w 图2
Western blotting 法蛋白电泳显后VEGF 表达的图像
讨论
急性不可逆缺血后侧支循环的建立以血管生成
为主。除了生理因素如冠状动脉的灌注压和血流量，生长因子的作用已越来越重要，因为它们能诱导
血管生成［2］
。VEGF 也称血管通透因子，它有促进内皮增生、增强血管通透性、改变细胞外基质及加速
新血管形成的作用［3］
。血管生成是VEGF 主要的作用方式。本研究结果显示对照组除第2w 外，其他时间点缺血区心肌细胞VEGF 蛋白的表达逐渐增加。给与长效硝酸酯类药物后，实验组缺血区心肌细胞VEGF 的表达趋势与对照组相同，但表达明显高于对照组；实验组缺血区毛细血管密度除第2w 、第8w 外明显高于对照组，这可以说明长效硝酸酯类药物可促进缺血区心肌细胞VEGF 蛋白的表达，它们的高表达与缺血区毛细血管生成密切相关。本研究通过局部缺血心肌内VEGF 测定，观察了不同阻断时间的新生血管生成情况及生成趋势，显示VEGF 有促进心肌梗死区域新生血管形成、血管内皮生长因子（VEGF ）具有强大的促内皮增殖、促血
管生长作用。是目前公认的最具特异性的内源性血
管生长因子［4］
。既往有研究在冠状动脉中直接注入VEGF 蛋白，结果约50%患者的核素心肌显像提
示心肌缺血改善，
70%患者冠状动脉造影显示建立了良好的侧支循环
［5］
利用血管生长因子加速和/或
增加侧支循环的机理，近期已初步用于缺血性心肌疾病的。本研究取结扎冠状动脉的梗死区心肌
组织行VEGF 灰度值测定，发现无论实验组还是对照组，随着时间的增加，VEGF 逐渐增加。与对照组相比，实验组在第4w 、第6w 有显著差异。长效硝酸酯类药物应用组，缺血心肌内侧支循环的血流量增加，微血管的密度和数量均明显增多，因此其促进
冠状动脉侧支循环的生成，
可能与促进VEGF 生成有关，
从而促进血管内皮再生、抑制内膜增生、促进血管侧支循环建立和改善内皮细胞依赖性血管舒张
的作用。
近期研究发现，硝酸异山梨酯能够通过增加NO 的释放和提高其生物利用度，改善心衰患者的氧化应激损伤，进而降低冠心病患者的病死率。有
动物实验表明，
硝酸异山梨酯能减少冠状动脉硬化家兔冠状动脉血管结构的损害，改善内皮功能，减少血管超氧离子的生成［6-7］
。目前，越来越多学者正在开展对长效硝酸酯类药物的药理作用研究，尤其是对于冠状动脉侧支循环的影响［8］
，具有深远的临床意义。
参考文献
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