(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810992202.7
(22)申请日 2018.08.29
(71)申请人 北京科技大学
地址 100083 北京市海淀区学院路30号
(72)发明人 罗晖 孙宏旭 常雁红 胡清清
铃木秀一吕慧新
纳米烟嘴(74)专利代理机构 北京永新同创知识产权代理
有限公司 11376
代理人 程大军 栾星明
(51)Int.Cl.
C12P 13/04(2006.01)
C12N 9/88(2006.01)
C12N 9/10(2006.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
本发明涉及酶催化制备L -苏式-对甲砜基苯
丝氨酸的方法，特别是涉及利用L -β-羟基-α-
氨基酸合成酶催化甘氨酸和对甲砜基苯丝氨酸
制备L -苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法。本发明
流氓猫
还涉及用于本发明方法的制备系统以及L -β-羟
基-α-
氨基酸合成酶。
权利要求书1页 说明书10页序列表10页CN 110872604 A 2020.03.10
C N 110872604
A
1.酶催化制备L ‐苏式‐对甲砜基苯丝氨酸的方法，包括以下步骤：
(a)使甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L ‐β‐羟基‐α‐氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中反应， (b)固液分离得到包含L ‐苏式‐对甲砜基苯丝氨酸的液相，
(c)将步骤(b)中得到的液相降温以使L ‐苏式‐对甲砜基苯丝氨酸沉淀析出，和nc6000
(d)固液分离得到沉淀析出的L ‐苏式‐对甲砜基苯丝氨酸。
2.酶催化制备L ‐苏式‐对甲砜基苯丝氨酸的方法，包括以下步骤：
(a)使甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L ‐β‐羟基‐α‐氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中反应，
(b)固液分离得到包含L ‐苏式‐对甲砜基苯丝氨酸的液相，
(c)将步骤(b)中得到的液相降温以使L ‐苏式‐对甲砜基苯丝氨酸沉淀析出，
(d)固液分离得到沉淀析出的L ‐苏式‐对甲砜基苯丝氨酸，和
(e)将步骤(d)产生的液相用于步骤(a)的反应。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(a)的反应温度在4‐50℃之间，例如10‐30℃之间，15‐28℃之间。
4.权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(c)的降温温度在‐5℃至25℃之间，例如0‐10℃之间，0‐4℃之间。
5.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(a)中加入L ‐赤式‐对甲砜基苯丝氨酸晶种，优选在搅拌下加入；和/或在步骤(c)的降温期间加入L ‐苏式‐对甲砜基苯丝氨酸晶种，优选在搅拌下加入。
6.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(a)中加入5‐磷酸吡哆醛。
7.权利要求1或2所述的方法，其中，所述助溶剂选自以下物质：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1‐戊醇、2‐戊醇、3‐戊醇、2‐甲基‐1‐丁醇、3‐甲基‐1‐丁醇、2‐甲基‐2‐丁醇、3‐甲基‐2‐丁醇、2,2‐二甲基丙醇、乙二醇、丙三醇、巯基乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯醚、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙醇胺、乙二醇二甲醚、甲基叔丁基醚、四丁基溴化铵、三乙胺、咪唑、吡啶、二甲基四氢呋喃、十二烷基磺酸钠、3‐吗
啉丙磺酸、β-环糊精和亚硫酸氢钠；优选选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇和丙酮。
8.权利要求1或2所述的方法，其中，助溶剂在水溶液体系中的体积浓度为5‐60％，例如10‐50％，或20‐40％。
9.用于权利要求1‐8任一项所述方法的制备系统，该制备系统包括：1)反应装置，该反应装置用于使甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L ‐β‐羟基‐α‐氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中反应；2)固液分离装置；3)降温装置。
10.L ‐β‐羟基‐基β氨基酸合成酶，具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者具有在SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上进行1‐10个或1‐5个或1‐3个氨基酸残基替换、增加或缺失但具有L ‐β‐羟基‐α‐氨基酸合成酶活性的氨基酸序列。
权 利 要 求 书1/1页CN 110872604 A
酶催化制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法
技术领域
[0001]本发明涉及酶催化制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法，特别是涉及利用L-β-羟基-α-氨基酸合
成酶催化甘氨酸和对甲砜基苯丝氨酸制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法。本发明还涉及用于本发明方法的制备系统以及L-β-羟基-α-氨基酸合成酶。
背景技术
[0002]L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸是生产甲砜霉素及其氟化衍生物氟甲砜霉素(氟苯尼考)的原料L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的前体物质。甲砜霉素和氟苯尼考均是拥有广泛用途的广谱抗生素，近年来，人们对他们的需求量正在逐年增加。
[0003]目前，生产L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸主要通过化学法合成(例如，参见韩玉英等.对甲砜基苯丝氨酸铜合成的研究.化学工业与工程，2011，28(2):29-34；以及韩玉英等.DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的合成及拆分.精细化工，2011，28(6):599-602,619)，但化学法存在反应步骤较长，反应条件苛刻，生产成本高，对环境不友好等特点。
[0004]鉴于目前化学法生产L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸存在诸多问题，亟待开发出能够克服一种或多种上述缺点的制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法。
发明内容
[0005]本发明的第一方面涉及酶催化制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法，通过该方法能够以温和且
环境友好的反应条件制备并通过简单分离就可得到L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸。
[0006]本发明的第二方面涉及利用第一方面的方法产生的废料制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法中。换句话说，该制备方法实现了反应体系的重复使用。
[0007]本发明的第三方面涉及用于上述第一方面的方法和第二方面的方法的制备系统。[0008]本发明的第四方面涉及可以用于上述第一方面的方法和第二方面的方法的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶。
聚乙二醇辛基苯基醚具体实施方式
[0009]如上所述，本发明的第一方面涉及酶催化制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法，并通过简单分离制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法。所述L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸结构式如下：
[0010]
[0011]具体来说，本发明提供酶催化制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的方法，所述方法包
括以下步骤：
[0012](a)使甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中反应，
[0013](b)固液分离得到包含L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的液相，
[0014](c)将步骤(b)中得到的液相降温以使L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸沉淀析出，和[0015](d)固液分离得到沉淀析出的L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸。
[0016]在步骤(a)的反应体系中，甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下进行如下反应：
[0017]
[0018]上述反应中生成目标产物L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸与副产物L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，其中副产物L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸不能直接用于制备具有生物活性的产品。[0019]在本发明中，术语“L-β-羟基-α-氨基酸合成酶”泛指能够催化醛基(-CH(＝O))与氨基酸中的氨基(-NH2)发生缩合反应生成L-β-羟基-α-氨基酸的酶，特别是指能够催化醛基(-CH(＝O))与甘氨酸中的氨基(-NH2)发生缩合反应生成L-β-羟基-α-氨基酸的酶，尤其是指能够催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛发生缩合反应生成L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的酶，例如，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶包括L-苏氨酸醛缩酶、L-苯丝氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶等等。
服务器审计
[0020]在本发明中，应当理解所给出的数值点包括适当的偏差，例如所给出值±10％，优选±5％，更优选±3％，更优选±1％内的偏差。
[0021]在本发明中，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶在反应中的用量没有特别的要求。用量少，反应进行的慢，所需反应时间长；用量多，反应进行的快，所需反应时间短。可以根据反应需要选择和调节L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的用量。
[0022]在本发明中，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活性以其催化分解L-苯丝氨酸生成苯甲醛和甘氨酸的能力进行衡量。在本发明中，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活性定义为：在约30℃、pH为约8.5和L-苯丝氨酸浓度为约10mmol/L的条件下，每分钟催化L-苯丝氨酸生成1μmol苯甲醛所需的酶量为1个活力单位(U)。
[0023]在本发明中，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活性测定方式为：
[0024](1)底物溶液的配制：称取DL-苯丝氨酸(以其中的L-苯丝氨酸为酶的底物)于去离子水中，超声使其完全溶解，再加入5-磷酸吡哆醛(PLP)，调节pH＝8.5，使得最终溶液中包含40mmol/L DL-苯丝氨酸、40μmol/L PLP。
[0025](2)反应条件：取10μl酶液、190μl去离子水、200μl底物溶液于1.5ml离心管中混匀，于30℃下计时反应，反应10min时立即加入400μl 1.7％磷酸终止液混匀终止反应。取终止后的反应液测量其290nm处的吸光度，与苯甲醛浓度—290nm吸光度标准曲线进行比较，
得到反应液中的苯甲醛浓度，进而计算得到L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活力单位。[0026]需要说明的是，在本发明的方法中，甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应需要使用L-β-羟基-α-氨基酸合成酶进行催化，而不能使用D-β-羟基-α-氨基酸合成酶(例如D-苏氨酸醛缩酶)进行催化，因为D-β-羟基-α-氨基酸合成酶催化甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应生成上述两个产物的手性对映体D-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和D-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。由于生产甲砜霉素及其氟化衍生物的活性前体是L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸，其D构型对映体不具有生物活性，需要通过复杂的化学法再转化获得L构型的产物。因此，使用D-β-羟基-α-氨基酸合成酶在生产中不能通过简单分离获得目标产物L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸，即，使用D-β-羟基-α-氨基酸合成酶催化甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应不能实现本发明的目的。
[0027]作为本发明的反应底物，甘氨酸易溶于水，而对甲砜基苯甲醛在水中的溶解度非常低，需要加入助溶剂来在提高对甲砜基苯甲醛在水中的溶解度。优选地，对甲砜基苯甲醛和甘氨酸均以饱和状态溶解在反应体系中。优选地，对甲砜基苯甲醛以远大于其溶解度的量加入反应体系中。更优选加入到反应体系中的甘氨酸的摩尔量大于对甲砜基苯甲醛的摩尔量。例如，甘氨酸以0.5-2mol/L，例如0.6-1.5mol/L，0.8-1.2mol/L的浓度加入到反应体系中，对甲砜基苯甲醛以0.1-0.8mol/L，例如0.2-0.6mol/L，0.2-0.5mol/L的浓度加入到反应体系中。
[0028]在本发明中，可以使用的助溶剂选自以下中的一种或多种：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基丙醇、乙二醇、丙三醇、巯基乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、聚乙二醇6000(PEG 6000)、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、乙腈、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙醇胺(DMAE)、乙二醇二甲醚(DME)、甲基叔丁基醚、四丁基溴化铵、三乙胺、咪唑、吡啶、二甲基四氢呋喃、十二烷基磺酸钠(SDS)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、β-环糊精和亚硫酸氢钠。优选选自DMSO、DMF、乙醇和丙酮。
[0029]优选地，助溶剂在水溶液中的体积浓度不超过60％，优选地，不超过55％，不超过50％，不超过45％，不超过40％，不超过35％。优选地，助溶剂的体积浓度为至少5％，至少10％，至少12％，至少15％，至少20％，至少22％，至少25％，至少30％。
[0030]可以在步骤(a)中的反应体系中加入5-磷酸吡哆醛(PLP)，5-磷酸吡哆醛作为L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的辅酶可以提高酶的活性。但是，5-磷酸吡哆醛在本发明的方法中不是必须的。在加入5-磷酸吡哆醛的情况下，5-磷酸吡哆醛的加入量可以为不超过200μmol/ L，例如不超过100μmol/L，不超出80μmol/L，不超过60μmol/L，不超过50μmol/L。
[0031]步骤(a)的反应可以在宽范围的温度条件下进行，例如，4-50℃的温度范围内，10-30℃的温度范围内，15-28℃的温度范围内。一般而言，温度越高，反应速度越快，但是，有可能造成副产物生成过多；温度越低，反应速度越慢，但是，可能有利于目标产物的形成。因此，根据酶的催化反应特点选择所需反应温度，但是通常在4-50℃温度范围内。
[0032]步骤(a)的反应体系的pH可以在5-10的范围内，例如，6-9的范围内，6-8的范围内，6-7的范围内。可以在反应体系中使用缓冲液，也可以不使用缓冲液。从简化工艺的角度来说，优选不使用缓冲液。
[0033]步骤(a)的反应优选在搅拌下进行，搅拌可以连续进行，也可以间断进行。搅拌速
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议