(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111535765.1
(22)申请日 2021.12.15
(71)申请人 徐州市中心医院
地址 221000 江苏省徐州市解放路199号
(72)发明人 孟箭 周霖 李欣然 顾徐嘉
陈霖
(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限
公司 32200
专利代理师 曹翠珍
储槽(51)Int.Cl.
C12N 15/113(2010.01)
C12N 15/867(2006.01)
A61K 31/713(2006.01)
A61P 1/02(2006.01)
A61P 25/00(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种敲低PXYLP1基因表达的
shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用，通过
RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备，将双链
DNA oligo与线性化的载体相连，将连接产物转
夹RNA慢病毒载体，敲低TSCC内源性PXYLP1基因
的表达，抑制了TSCC细胞的增殖能力，诱导了
TSCC细胞的凋亡，
从而抑制体内肿瘤生长。权利要求书1页 说明书10页序列表1页 附图9页CN 114457075 A 2022.05.10
C N 114457075
A
1.一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：
SEQ 1：
5’‑CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG ‑3’
SEQ 2：
5’‑AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG ‑3’。
2.根据权利要求1所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。
3.一种权利要求1所述的敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体由权利要求1合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。
4.一种权利要求3所述的慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)针对RNA干扰靶点序列设计合成双链DNA oligo：合成权利要求1所述的DNA oligo的正链和反链，将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min；自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链DNA；
2)线性化载体的制备：使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化，37℃反应1h，切胶回收目的片段；
3)生成双链DNA oligo与线性化载体的连接产物：将步骤1)得到的双链DNA oligo与步骤2)得到的线性化载体于20μl反应体系中，16℃反应1h ‑3h，连接产物命名为psc54972；
4)克隆转化：将步骤3)连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行PCR鉴定；
5)质粒抽提：将测序正确的菌液转接于培养基中，提取质粒，将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
kuse006
5.如权利要求1所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA在制备舌鳞癌诊断、和预后预测药物中的应用。
6.如权利要求2所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌诊断、和预后预测药物中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 114457075 A
洗车房一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法
和应用
技术领域
[0001]本发明涉及癌症领域，具体涉及短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法及其应用。
背景技术
[0002]舌鳞状细胞癌(TSCC)是常见的恶性肿瘤之一，具有高死亡率与发病率。它的发展是一个涉及遗传改变和表观遗传修饰的多步骤过程。TSCC是许多变量的致病因素，多种遗传改变和环境因素的积累，如烟草使用，饮酒，慢性炎症和人乳头瘤病毒(HPV)感染等，最近一些报道表明年轻成人的TSCC在发病率增加，特别是在女性中，远处转移率较高，预后较差。因此，由不同风险因素引起的TSCC可能具有不同的分子基础，涉及细胞周期控制和衰老控制的丧失，细胞凋亡的失调，以及口腔扁平苔藓和白班的发生等方面。
[0003]目前化合物或天然提取物质在舌鳞状细胞癌的中应用比较广泛，例如CN 110680815 A和CN 111773218 A，但是小干扰RNA生物药物在制备舌鳞状细胞癌方面的应用较少，化疗药物副作用大，选择性差，靶向性较低，应用有局限性。
[0004]评价肿瘤生物学行为的主要指标有肿瘤细胞增殖、生长形成能力、凋亡等。本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1，有利于辅助舌鳞癌诊断、和预后预测。
发明内容
[0005]针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法，通过通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，以实现抑制肿瘤的作用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
镜片镀膜机[0007]一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：
[0008]SEQ 1：
[0009]5’‑CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG‑3’[0010]SEQ 2：
[0011]5’‑AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG‑3’。[0012]优选地，所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。
[0013]本发明的第二个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体，所述慢病毒载体由上述合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。
[0014]本发明的第三个目的是提供所述的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
[0015]1)针对RNA干扰靶点序列设计合成双链DNA oligo：合成权利要求1所述的DNA oligo的正链和反链，将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min；自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链DNA；
[0016]2)线性化载体的制备：使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化，37℃反应1h，切胶回收目的片段；
[0017]3)生成双链DNA oligo与线性化载体的连接产物：将步骤1)得到的双链DNA oligo 与步骤2)得到的线性化载体于20μl反应体系中，16℃反应1h‑3h，连接产物命名为psc54972；
[0018]4)克隆转化：将步骤3)连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行PCR 鉴定；
[0019]5)质粒抽提：将测序正确的菌液转接于培养基中，提取质粒，将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
[0020]本发明的第四个目的是提供所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA在制备舌鳞癌诊断、和预后预测药物中的应用。
[0021]本发明的第四个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌诊断、和预后预测药物中的应用。
[0022]本发明的有益效果在于：本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，包括针对PXYLP1基因的干扰靶点序列，包装构建慢病毒，对PXYLP1基因进行敲减后，发现显著影响舌鳞癌细胞CAL‑27细胞和SCC‑25细胞的增殖，影响细胞生长形成能力，并促进细胞的凋亡，并通过体内实验进行了验证，表明该基因可能调控肿瘤的发生发展，可能成为舌鳞癌的一个潜在靶点，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1，有利于辅助舌鳞癌诊断、和预后预测。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]图1为为线粒化载体的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道1：1kb Marker：从上至下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：Age I和EcoR I双酶切线性化后的载体质粒；泳道3：没有酶切的载体质粒；
[0025]图2为RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图；
[0026]图3为琼脂糖凝胶电泳检测条带；其中泳道1：阴性对照(ddH2O)，排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；泳道2：自连对照(空载体自连对照组)；泳道3：250bp Marker：从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4‑8：单克隆psc54972‑1,2,3,4,5；
[0027]图4为PXYLP1在癌组织和癌旁组织中的表达差异图；
[0028]图5为PXYLP1在SCC‑25细胞和CAL‑27细胞中mRNA的表达丰度；
[0029]图6为CAL‑27细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒；
[0030]图7为SCC‑25细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒；
[0031]图8为mRNA水平PXYLP1基因消减效率示意图，其中左侧为CAL‑27细胞结果，右侧为SCC‑25细胞结果；
[0032]图9为靶点降低PXYLP1基因蛋白水平表达，左侧为CAL‑27细胞结果，右侧为SCC‑25细胞结果；
[0033]图10为使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组CAL‑27细胞的凋亡情况结果图；[0034]图11为使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组SCC‑25细胞的凋亡情况结果图；[0035]图12为敲减PXYLP1后CAL‑27细胞周期的变化结果图；
[0036]图13为敲减PXYLP1后SCC‑25细胞周期的变化结果图；
[0037]图14为敲减PXYLP1后CAL‑27细胞的增殖速率变化Celigo细胞计数结果显示图；[0038]图15为敲减PXYLP1后SCC‑25细胞的增殖速率变化Celigo细胞计数结果显示图；[0039]图16为敲减PXYLP1后CAL‑27细胞的增殖速率变化MTT检测结果显示显示图；[0040]图17为敲减PXYLP1后SCC‑25细胞的增殖速率变化MTT检测结果显示显示图；[0041]图18为敲减PXYLP1后，实验组(KD)和对照组(NC)CAL‑27异种移植物的肿瘤大小和重量变化对比图；
[0042]图19为敲减PXYLP1后，实验组(KD)和对照组(NC)动物活体成像实验显示对比图。
具体实施方式
[0043]下面结合具体实例对本发明的发明方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。
[0044]我们的研究发现设计针对PXYLP1基因的干扰靶点序列，包装构建慢病毒，对PXYLP1基因进行
敲减后，会显著影响舌鳞癌细胞CAL‑27细胞和SCC‑25细胞的增殖，影响细胞生长形成能力，并促进细胞的凋亡，并通过体内实验进行了验证。表明该基因可能调控肿瘤的发生发展，可能成为舌鳞癌的一个潜在靶点。
文具盒生产过程[0045](一)实验方法
[0046]1、基因信息
[0047]在线资源TCGA数据库(ualcan.path.uab.edu/)用于生成舌鳞癌中癌与癌旁组织样本中PXYLP1表达差异。
载体构建
[0048]2、细胞系和细胞培养
[0049]CAL‑27和SCC‑25TSCC细胞系购自中国科学院(中国上海)，两种细胞系均在液氮罐中取出进行复苏，在补充有10％胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素和100μg/100mL链霉素的
的潮湿气氛中温育。Western Blot外源验RPMI 1640培养基中培养，并在37℃下在含5％CO
2
证靶点有效性。
[0050]3、RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备
[0051] 3.1 RNA干扰靶点设计
[0052]根据RNA干扰序列设计原则，以PXYLP1基因为模板，设计多个19‑21nt RNA干扰靶
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