蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+)-PPMel的构建及分析

陕西农业科学2020,66(05)：62-65Shaanxi Journai of Agriculturai Sciences

蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+) -PPMet

水泵远程监控的构建及分析

情趣口香糖

免蒸加气砖郭新军

(西安文理学院生物与环境工程学院，陕西西安710065)

摘要：为了探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法，对重组质粒pGEXBTB/PPMet中的蜂毒前溶血肽原基因进行了更换载体处理，并重新构建了蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+)-PPMet，为进一步转化大肠杆菌感受态细胞并进行蜂毒前溶血肽原基因的表达提供了材料。相关序列的生物信息学分析表明，新的重组质粒可表达含有106个氨基酸残基的融合蛋白，其中包括His标签。该融合蛋白没有信号肽序列，但存在跨膜区域，其在大肠杆菌中的表达需进一步探讨。

关键词：蜂毒前溶血肽原；蜂毒肽;pET-28a(+)；重组质粒园林垃圾桶

作为蜂毒的主要活性成分之一&1'，蜂毒肽(MelitUn)在蜜蜂体内是由其前体—

—

蜂毒溶血肽原(Promelittin)水解而成的[2]，而蜂毒溶血肽原是蜂毒前溶血肽原(Prepromelittin)加工后的产物。蜂毒前溶血肽原包括70个氨基酸残基，由信号肽(第1至第21氨基酸残基)、低复杂性区域(第22至第43氨基酸残基)和蜂毒肽结构域(第44至第69氨基酸残基)等构成⑶%

利用基因工程技术生产蜂毒肽被看作一条有效获得蜂毒肽的途径，具有一定应用前景％前期我们构建了蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4TB/PPMe-，并在大肠杆菌BL21感受态细胞中诱导表达，成功获得了目的融合蛋白％但由于GST标签自身相对分子质量较大，而目的蛋白又非常小，对目的片段的纯化等可能会有较大影响。笔者研究考虑到蜂毒前溶血肽原自身具有较大的溶解度，对细胞膜的破坏能力较低，尝试使用分子量较小的Hm标签，将改造后的蜂毒前溶血肽原基因由重组质粒pGEX-4TB/PPMe-重构到pET-28a(+)载体上，构建了pET-28a(+)-PPMS重组质粒，并对其进行生物信息学方面分析，为探讨其在原核细胞中的表达提供基础％

1材料和方法

1.1实验材料与主要试剂

实验室前期对蜂毒前溶血肽原基因进行了改

并合成后的,

原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMey 相关材料保存于本实验室％载体构建

实验所用pET-28a(+)表达载体、大肠杆菌(E.coli)TOP10感受态细胞及T4DNA连接酶、限制性内切酶EccRI和Sall等分子生物学试剂均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供％

1.2实验方法

1.2.1蜂毒前溶血肽原基因载体更换利用限制性内切酶EccRI和Sall对原构建的重组质粒pGEX-4T-1/PPMe-进行双酶切，同时利用限制性内切酶EccRI和Sall对载体pET-28a(+)进行双酶切％各酶切体系(50!L)中均包含反应模板4 !g,10xFD Buffer5!L,SalI1!(10U-咽“), EccRI1!(10U-咽"),ddH2O39咽。酶切体系置于恒温水浴锅中37°C条件下反应2h%回收目的基因片段和酶切后的载体pET-28a (+)，利用T4DNA连接酶将获得的目的基因片段与酶切后的载体pET-28a(+)进行连接，获得重组质粒pET-28a(+)-PPMei(图1)%连接体系(20 !L)中包含目的基因片段8!L，酶切后载体pET-28a(+)4[jl L,10x T4DNA lijaso Buffer2[jl L,T4 DNAijaso1j L(5U・j L'1),ddH?O补充至20 j L%上述连接混合液置于PCR仪中22C条件下1h%

获得的质化菌TOP10

收稿日期：2019-12-20修回日期：2020-01-20

基金项目：西安市科技计划项目(2016CXWL12)；陕西省教育厅科研计划项目(17JK1128)%作者简介：郭新军(1979-)，男，山东德州人，博士，副教授，从事动物学与发育生物学研究％

TJA1100・62・

本文发布于:2024-09-21 01:45:08，感谢您对本站的认可！

本文链接：https://www.17tex.com/tex/2/346125.html

上一篇：广宿主稳定表达载体pQMV和pGMP的构建

下一篇：小学整本书阅读教学评价载体的构建