幻听的中药*基金项目：国家自然科学基金青年基金（No.39900004）和国家重点基础研究发展规化(973)项目（No.2001CB109005）资助。胡玉琴：女，1962年生，博士研究生。Email:<yuqinhu316a@vip.sina>.**通讯作者。Author for correspondence.E-mail:<dfh313@public.bta>.收稿日期：2003-05-13接受日期：2003-06-05
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(2):202~205
·研究论文
·广宿主稳定表达载体pQMV 和pGMP 的构建* 胡玉琴1张杰1宋福平1束长龙1
黄大昉2**
（1.中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，
北京100094；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081）
摘要：以
高效表达载体pET-29a 为基础，将广宿主载体pUCP19中稳定的假单胞菌（ DNA 复制子和自行分离克隆的荧光假单胞菌()P303组成型表达启动子P P 303插入其中，分别获得了重组载体 pQMV(4.6kb)和pGMP(5.6kb)。它们均含有假单胞菌和大肠杆菌复制子、荧光假单胞菌内源强启动子，以及包含8~11个限制性内切酶多克隆酶切位点；
此外，载体pGMP 还含有绿荧光蛋白基因作为辅助检测标记。连续培养和继代培养测定， 这两种载体在荧光假单胞菌中的稳定性均为100%（120h ）。
关键词：绿荧光蛋白基因；荧光假单胞菌；
启动子；穿梭表达载体Construction of Stable Shuttle Expression Vectors pQMV and pGMP
HU Yu-Qin 1
ZHANG Jie 1
SONG Fu-Ping 1SHU Chang-Long 1
HUANG Da-Fang 2**
(1.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Academy
防火罩
of Agricultural Sciences,Beijing 100094,China;2.Biotechnology Research Institute ,
精炼渣Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)
The replicon of
plasmid DNA from pUCP19,and a new strong promoter P P 303,cloned from
P303strain,were inserted into plasmid pET-29a,a high level expression vector of
.The recombinant
shuttle expression plasmid pQMV(4.6kb)and pGMP(5.6kb)were obtained respectively.The vector pGMP containing
gene was
脱蜡
especially available for detection and monitoring.The stability of the two expression vectors were 100%(120h)in P303strain of
.Both recombinant vectors will be powerful for research on gene expression,regulation and construction of
engineered strains of
.
green fluorescence protein gene (
);
;promoter;shuttle expression vector
假单胞菌()是微生物的重要类，
具有很大的开发应用潜力。如荧光假单胞菌（
）广泛分布于植物根际和根表，对多种植物病害有良好的拮抗作用；恶臭假单胞菌()
能分解一般微生物难以分解的工业废物和污染物，如多氯代联苯类、萘等。Obukowicz 等[1]利用转座子成功地将苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因导入在根部定殖的荧光假单胞菌菌株，1995年张光焰等[2]将基因导入具有防病作用的荧光假单胞菌P303菌株，均得到了表达，显示了良好的杀虫效
果。Wackett 等[3]将编码两种多组分氧化酶的7个基
因导入到一株恶臭假单胞菌菌株，使其降解多卤代化合物的能力大大加强。目前国内假单胞菌的工作多在直接应用，有关假单胞菌载体构建、高效启动子分离克隆、表达调控等分子生物学研究报道较少。本研究利用广宿主载体pUCP19中稳定的假单胞菌复制子和自行分离克隆的荧光假单胞菌P303启动子(P P303)，以近年应用较多的绿荧光蛋白基因
[4]
作为筛选和检测标记，构建了含有强启动子、转录终止子、多克隆位点等多个元件的广宿主稳定
第2期胡玉琴等：广宿主稳定表达载体pQMV 和pGMP 的构建表1供试菌株与质粒Table l Strains and plasmids
表达载体，为假单胞菌基因表达调控及其遗传改良研究提供了安全稳定和应用方便的工具。1
材料和方法
1.1菌株与质粒见表l 。1.2培养基与培养条件
采用LB 培养基。大肠杆菌于37℃培养，
荧光假单胞菌于28℃培养。1.3抗生素及使用浓度
青霉素(Amp)、利福平(Rif)和卡那霉素(Kan)，
使用浓度为50μg/mL 。
1.4生化试剂和酶
内切酶、T 4DNA 连接酶、T 4DNA 聚合酶、X-Gal 、IPTG 、Pfu DNA 聚合酶等分别购自Gibcol 、MBI 、TaKaRa 、Promega 公司；DNA 回收柱和溶菌酶购自Sigma 公司。1.5质粒DNA 提取、酶切、去磷酸化、连接和转化
参照于等[5]方法。蛋白电泳样品处理采用如下方法：取适量菌液超声波破碎，12000r/min 离心，取
60μL 上清加入30μL 3х加样缓冲液，100℃,6min ，12000r/min 离心2min ，取10μＬ进行电泳。
1.6连续培养法和连续稀释培养法检测载体质粒的稳定性
参照于等[5]方法。1.7荧光检测与记录
用紫外检测仪在300~360nm 波长紫外光照射下检测菌落。2
结果
2.1荧光假单胞菌启动子克隆及功能分析2.1.1启动子的分离克隆荧光假单胞菌P303的启动子用本组构建的启动子探针载体pHGLc 进行分离克隆，pHGLc 含H Ⅰ等酶切位点，H Ⅰ之前无启动子，之后含核糖体结合位点和绿荧光蛋白
基因（）
。用3AI 部分酶切P303的总DNA ，与pHGLc （经H Ⅰ酶切并经脱磷酸化处理）连接，
转化
JM110，获得7个在自然光下为绿菌落：1C 、2C 、3C 、4C 、29C 、9A 和10B （图1），表明已
克隆到P303菌株组成型表达启动子，相应重组质粒命名为p1C 、p2C 、p3C 、p4C 、p29C 、p9A 和p10B；启动子命名为P 1C 、P 2C 、P 3C 、P 4C 、P 29C 、P 9A 和P 10B 。
图1.表达GFP 蛋白的重组菌落
Fig.1.Recombinants of expressing
abp-486GFP protein
1C 、2C 、3C 、4C 、29C 、9A 和10B 为自然光下可视的绿菌落，其余为白菌落。1C,2C,3C,4C,29C,9A and 10B are green recombinants visualized under general light ，others are white.
2.1.2启动子的功能分析和亚克隆以为报告基因，分别在JM110和荧光假单胞菌P303中对
P 1C 、
P 3C 和P P303等启动子与已知的强启动子P Lac 、P T7启动子和组成型转录的大肠杆
菌
供试菌株与质粒特性
来源
Strain and plasmid Characterization
Source
大肠杆菌JM110AB Store in Lab
1recA
荧光假单胞菌P303Rif r ，colonization in crop roots with antifungal activities Store in Lab
PQ303P303containing pQMV,Kan r This study PG303
P303containing pGMP,Kan r
This study 质粒Plasmids pHGLc Amp r ,promoter probe cloning vector (3.8kb)
This study pEGH Amp r ,P T7,
gene expressing vector (6.1kb)This study pUG18Amp r
,P Lac ,expressing vector containing gene (3.5kb)
This study p1C Amp r ,P303promoter P 1C
,gene (6.2kb)
This study pNm19Amp r
,P Nm and
gene,shuttle vector (6.1kb)This study p2C Amp r
,
P303promoter PP 303,gene (4.3kb)
This study p3C Amp r
,P303promoter P 3C ,gene (8.0kb)
This study pQMG Kan r
,P P303and gene,shuttle vector (5.4kb)
This study pMVG Kan r
,P T7and gene,shuttle vector (5.2kb)This study pUGH Amp r ,P Lac ,expressing vector containing gene,Store in Lab rep of Pf (5.3kb)pQMV Kan r ,P P303promoter,shuttle vector (4.6kb)
This study pMVZ Kan r ,shuttle vector (4.2kb)
This study pUCP19Amp,r
Cloning and expressing vector,rep of Pf (4.5kb)Store in Lab pET-29a Kan r ,high-efficient expression vector (5.4kb)
Store in Lab pGMP Kan r ,gene and P P303promoter,shuttle vector(5.6kb)This study pUGH2
Amp r ,P Lac ,expressing vector containing
gene (4.3kb)
Store in Lab
203
农业生物技术学报2004年载体构建
表2用连续培养法检测质粒稳定性
Table 2Stability of plasmids in P303with continuous culture
表3连续稀释培养法各菌株的稳定性
Table 3Stability of plasmids in P303with serial dilution culture
菌株质粒阳性菌落百分率/%
Strain
Plasmid
Percentage of positive colonies with antibiotic resistance
1st 2nd 3rd 4th 5th 6th 7th PG303pGMP 100100100100100100100PQ303
pQMV
100
100
100
100
100
100
100
菌株质粒阳性菌落百分率/%
Strain Plasmid Percentage of positive colonies with antibiotic resistance
24h 36h 48h 60h 72h 84h 120h PG303pGMP 100100100100100100100PQ303
pQMV
100
100
100
100
100
100
100
新霉素抗性基因启动子P Nm 的活性进行比较。SDS-PAGE 结果表明，它们表达的GFP 蛋白量相当，说明P P303等启动子与P Lac 、P T7和P N m 同属于强启动子（图2和3）。进一步对P 2C 启动子DNA 片段(约2kb)进行亚克隆，所获得的467bp DNA 片段仍具有很强的启动功能，将该片段命名为启动子P P303。
2.2
穿梭表达载体pQMV 的构建2.2.1穿梭质粒pMVZ 的构建用Ⅰ/Ⅰ双酶
切含有假单胞菌复制子(P rep )的质粒pUCP19，回收约1.2kb 的P rep 片段，同时用Ⅰ/Ⅱ双切质粒pET-29a ，回收3kb DNA 片段，将两个回收的DNA 片
段补平、连接，转化JM110菌株，
在Kan 平板上筛选连接阳性转化子即重组质粒pMVZ （4.2kb ）
2.2.2穿梭表达载体pQMV 的构建用
Ⅰ/Ⅰ双酶切pMVZ ，除去多克隆位点前的T7启动
子，同时用
Ⅰ/Ⅰ双酶切质粒p2C ，回收约0.5kb 的P P303DNA 片段。将2个回收的DNA 片段连接转化，在Kan 平板上筛选阳性转化子pQMV ，它含有假单胞菌和复制子、荧光假单胞菌内源启动子P P303和Kan 抗性基因，及11个限制性内切酶酶切位点的多克隆位点（MCS ）。
图2.不同启动子在JM110中启动
基因表达的电
泳分析
Fig.2.SDS-PAGE analysis of expression products of
gene activated by different promoters in
1,JM110;2,pHGLc (no promoter ahead
gene);3,pEGH(
P T7);4,pUG18(P Lac );5,p1C(P 1C );6,pNm19(P Nm );7,pPFC2(P P303);8,p3C(P 3C );M,standard protein marker (97.4,66.2,
43.0,31.0,20.1and 14.4kD)
2.3含基因的广宿主稳定表达载体pGMP 的构建
用Ⅱ酶切pUGH2，回收1kb 含基因的DNA 片段，插入穿梭表达
载体pQMV 的
Ⅱ位点获得重组质粒pGMP （5.6kb ），它含有假单胞菌和复制子、基因、荧光假单胞菌内源启动子
P P303和Kan 抗性基因，
以及多克隆位点（8个限制性内切酶酶切位点）
。pQMV 和pGMP 物理图谱及其构建流程见图4。
图3.不同启动子在P303中启动基因表达的电泳分析
Fig.3.SDS-PAGE analysis of expression products of
gene
activated by different promoters in
1and 2,pQMG(P P303);3,PQ303;4,pMVG(P T7);5,pUGH(P L ac );6,pNm19(P Nm );7,P303;M,standard protein marker (97.4,66.2,43.0,
31.0,20.1and 14.4kD).
2.4
穿梭表达载体pQMV 和pGMP 的质粒稳定性检测
分别采用连续培养法和连续稀释培养法
（每隔7h 稀释1次，此时细胞处在对数生长后期，OD 660在0.75~0.85之间）检测载体pQMV 和pGMP 在荧光假单胞菌P303中的稳定性，Kan 抗性菌落百分率均为100%(表2和3)，证明pQMV 和pGMP 能在P303中稳定存在。
3讨论
遗传工程微生物作为活体应用于环境必须具
备
204
第2期胡玉琴等：广宿主稳定表达载体pQMV 和pGMP 的构建图4.
穿梭表达载体pQMV 和pGMP 的构建流程图Fig 4.Construction of
shuttle
expression vector pQMV and
pGMP
基本条件：1)在环境中存活力强；2)外源基因能稳定
存在和表达（取决于质粒复制子的稳定性和具有启
动外源基因表达的启动子）；3)对环境安全。目前，
国际获批准释放到环境的活体遗传工程微生物只有
根瘤菌()等少数几种，而且只能限制性释放。因此在选择有效的受体菌和外源基因的前提下，
提高工程菌的安全性、稳定性就显得尤为重要。本研
究针对上述要求，从假单胞菌载体改造切入，选择基因、假单胞菌复制子和新克隆的荧光假单胞菌P303启动子等元件，以大肠杆菌高效表达载体pET-29a 为基础构建了无接合转移性能、对环境更加安全的广宿主表达载体pQMV 和pGMP 。出发载体pET-29a 带有pBR322的复制起点，并含有控制质粒拷贝分配的功能区(par)[6,7]。载体pUCP19带有来自恶臭假单胞菌质粒DNA 的复制子，在多种假
单胞菌中均能稳定复制和遗传[8,9]。采用荧光假单胞菌P303组成型表达的强启动子和绿荧光蛋白基因基因不仅可提高外源基因在多种细菌中的表达水平，而且易于进行基因产物的定性和定量检测。本项研究构建的重组质粒将为用于生防和环保的假单胞菌的基础研究和工程菌的研制提供更为实用的载体工具。
致谢：陈中义和潘映虹亦参加本研究工作，谨致谢意。
参考文献
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81~86
205
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