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学号:************
班级:11级生技班
同组者:赵莉、高瑞
【实验目的】
1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。 3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
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4、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法。5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
载体构建10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】
外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重
组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
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1、限制性核酸内切酶及酶切反应
体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只能用一种限制性核酸内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。选择具有相同限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。
单酶切法简单易行，但后期筛选工作比较复杂。各种限制性核酸内切酶都有其最佳反应条件，其中最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，为了实验中的方便，根据离子强度可将各种酶的缓冲液分为三类：高盐、中盐和低盐离子强度缓冲液。在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的酶量。一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μL，DNA的量增大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位（U）酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1μg pBR322 DNA。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。
2、载体与外源DNA的连接反应
在基因工程操作中,连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖于限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接
酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。
本实验的连接反应方式是互补粘性末端DNA片段之间的连接：
当载体和外源DNA用同一种限制性核酸内切酶切割时，产生相同的黏性末端，连接后形成的重组DNA分子仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列。若外源DNA插入片段和适当的载体存在同源黏性末端，这将是最方便的克隆途径。但是，在同黏性末端连接方案中，存在高背景和两向插入的弊端。
如果用两种能够产生相同的黏性末端的限制性核酸内切酶（同尾酶）切割时，虽然也可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子一般是消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。在特殊情况下，由两种同尾酶产生的黏性末端经连接后可以被其中一种酶切开或产生新的识别序列，
可以被第三种酶切割。
如果用两种产生不同的黏性末端的限制性核酸内切酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同黏性末端的DNA片段。十分显然，如果载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对限制性核酸内切酶切割，那么载体分子和外源DNA片段只能按一种取向退火形成重组DNA分子。重组后的DNA分子还可以用这对限制性核酸内切酶切割，回收外源目的DNA片段。
互补黏性末端连接方案也存在片段的多拷贝插入现象。但需要表达蛋白质产物时，多拷贝的插入，在没有拼接剪切型号的情况下，将会导致表达困难或紊乱。所以筛选时需要用限制性核酸内切酶图谱对单拷贝插入片段进行鉴定和筛选。适当的插入片段与载体分子比例能减少多拷贝插入片段的形成，一般选择的比例为2:1(插入片段摩尔数：载体摩尔数）。
3、感受态细胞的制备及质粒转化
构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即宿主细胞最容易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态，由受
体菌的遗传性状所决定，同时也受菌龄及环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
除自然转化外，细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，也可以成为易于接受并转化外源DNA的感受态细胞。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验要求，制备的感受态细胞暂不用时，可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。
经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。
影响感受态细胞制备及转化的因素：1）细胞的生长状态和密度：从甘油管中新鲜活化而不是多次转接的菌；培养至指数前期到指数期（OD600≈0.3-0.6）；应为限制-修饰系统缺陷菌株；受体细胞与所转化的载体性质应相匹配。2）质粒DNA的质量和浓度：超螺旋构象的质粒DNA，较其线性构象的转化率高10-100倍；加入DNA的体积不应超过感受态细胞的5%，1ng的cccDNA即可使50μL的感受态细胞达到饱和；对于同一类型的载体而言，分子量越大转化率越低。3）其他药品、试剂质量：如CaCl2应用高纯度药品、超纯水配制，过滤除菌、分装保存；所有试剂、容器、耗材等均需无菌处理；感受态细胞制备过程均需要无菌、冰浴操作。
本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的pUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（AMPr），在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒pUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素培养基上不生长。质粒pUC19进入E.coli DH 5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红。不含质粒的E.coli DH 5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，而是利用培养基中的
有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白菌落。挑取在氨苄青霉素培养基上生长的红菌落，通过扩增培养，可将转化的质粒提取出来，进行后续的酶切、连接等操作。
4、重组转化子的筛选与验证
重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法。
平板筛选法主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜筛选含有充足质粒的转化子。质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒pU
C19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒pUC19进入E.coli DH 5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coli DH 5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，而是利用培养基中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在pUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白菌落。
表1 麦康凯琼脂培养基的配方
成分（g/L） | 含量 | 作用 | pH |
蛋白胨 | 20 | 提供碳氮源、维生素和生长因子 | 7.1+/-0.2 |
乳糖 | 10 | 可发酵的糖类 |
牛胆盐 | 5.0 | 抑制革兰氏阳性菌的生长 |
氯化钠 | 5.0 | 亨润成型机炮筒公司维持均衡的渗透压 | 康复辅助器具技术
中性红 | v槽机 0.03 | pH指示剂：6.8（红）-8.0（黄） |
琼脂 | 14 | 凝固剂 |
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