在排除了其他问题后,我做了摩尔比的调整,需要做OD260的测量。不要怕浪费回收的载体和片段因为实际用量非常少,看了下面我们的实验实例就知道了。 1 比例应该在1:2-6之间(载体:片段;片段要多)。空气加温器
2 连接体系如果是20微升,载体和片段的总质量(微克)要在0.02微克~0.2微克之间。如果是10微升,则在0.01~0.1微克之间。我一般都用到接近上限。 3 EDTA不能太多。否则可能影响连接酶。
附加:
如何计算摩尔数和微克数(用20微升的链接体系,NEB的T4 DNA ligase)
公式:pmol数*kb数(双链)*0.65=微克数
实例:片段大小=555bp=0.555kb,浓度=0.19微克/微升
载体大小=4.969kb, 浓度=0.115微克/微升
选取:载体0.04pmol;片段0.12pmol(载体:片段=1:3)
代入公式:pmol数*kb数(双链)*0.65=微克数;
载体用0.129微克(1.12微升);片段用0.043微克(0.23微升):::注意20微升体系
载体构建>聚氨酯墙板得出:载体和片段的总质量=0.043+0.129=0.172微克(在20微升体系所要求的0.02~0.2微克之间)
连接体系:体积按需调整,我们喜欢用20ul的体系。你如果要用10ul的,把上述用量减半。
20ul体系:
3d水 15.65 ul,
片段 0.23 ul,
载体 1.12 ul,
将上面三个液体混匀,45摄氏度水浴5min,迅速插入冰中,2min玻璃垫片
保持在冰浴中,加入
10×buffer 2 ul
T4 DNA ligase 1 ul
混匀,4℃连接过夜
另外一种推算结果
设x1为DNA片段pmol数,x2为其ug数;设y1为载体pmol数,y2为载体ug数,a为DNA片段的kb数,b为载体的kb数,并且假定摩尔比为DNA片段:载体=3:1,则有
x1·a·0.65=x2
y1·b·0.65=y2
x烟囱脱硫1:y1=3
x2+y2=0.2(总质量)
最后提示:
不要怕测OD260浪费了回收的载体和片段,因为实际上用的很少(见上述)。不要嫌测OD值麻烦,因为非常必要,尤其是连接效率不高的质粒和片段。u型玻璃幕墙
根据酶切电泳条带估计用量通常都不能得到最大的连接效率,对初学者来说,估计通常不准。我有一次,按照估计的,两个板子才有一个克隆;按照摩尔比1:3连接得到了大约150个克隆;按照摩尔比1:10只得到了平均15个克隆/板。这说明:片段过多,过犹不及。