·论文·
文章编号:100528915 ( 2001) 012004204
Ξ
剑1岸1刘杰森1 张玲1李志英1 姚汝华
熊盛林洪
(华南理工大学生物工程系，广州510641 ;1 暨南大学生物工程研究所，广州510630)
摘要对原核表达载体p E T3c 进行改建，消去载体上非必需的Eco RⅠ、Hin d Ⅲ限制酶位点，然后在克隆位点Bam HⅠ处引入L acZ 片段，经此二步改建后的载体命名为pJ N982 。该载体保留了p E T3c 高效表达外源基因的能力，同时，其融合克隆位点由1 个增至7 个，并获得以目视法筛选重组子的能力。应用该载体在E1 c ol i BL 21 (D E3) pL y sS 中融合表达牛碱性成纤维细胞生长因子，表达量占菌体总蛋白30104 % 。破碎菌体上清经阳离子交换和肝素亲和两步层析，得纯度为95 %的重组蛋白，活性检测显示，重组蛋白具有与参照品一致的促有丝分裂活性。 关键词p E T载体；多克隆位点；目视法筛选；牛碱性成纤维细胞生长因子；表达
中图分类号: Q782 文献标识码:A
近年来，应用各种T7 噬菌体启动子载体在大肠杆菌中表达真核基因成为获得所需目的蛋白的一个重要途径1 ,2 。p E T3c 即是此类载体之一，它能高效表达它所携带的外源基因，同时本底表达水平极低3 , 但在p E T3c 中, 只有两个克隆位点: A T G 克隆位点N d e I及N 端融合克隆位点Ba m H I ，致其应用时受到部分局限。本文试行对p E T3c 进行两步改建, 使其融合克隆位点增至7 个，同时获得以目视法筛选重组子的可能性，大大提高了原载体的应用范围及可操作性: 第一步，在不影响p E T3c 的基本特性下，消去p E T3c 上的部分限制酶位点，获得的中间载体命名为pJ N981 ；第二步，在N 端融合位点Ba m H I 处引入L a cz 片段。经过上述二步改建后的载体命名为pJ N982 。应用此载体在大肠杆菌中表达牛碱性成纤维细胞生长因子( B ovine basic Fibro b last Growt h Facto r , Bb F GF) , 产物可溶, 表达量占菌体总蛋白30104 % 。购自Novagen 公司; 质粒p E T3c 、p U C18 分别购自Novagen 、MB I 公司；含Bb F GF cDNA的p U C18 质粒，由暨南大学生物工程研究所构建。 11112 主要试剂限制酶和修饰酶为Pro mega 和New England Bi olabs 产品；重组b F GF 参照品购自Pro mega 公司; PCR 引物委托上海生工公司合成，其序列分别为:
P Ⅰ:
5′2G ACG A G ATCTCC CAT AT G ACC AT G AT T ACG AAT TCG 23′P Ⅱ:
5′2A GTC A G A TC T T C A GC GGT GT G AAA TACC GCAC A G23′P Ⅲ:5′2G CC T A G A TC T G A T G GCC G CC GGG A GC A TC23′
P Ⅳ:5′2G A T G AA GC T T T C A G C T C T T A G CA G AC A T T G23′112 实验方法小麦草榨汁机
11211 DNA 体外重组DNA 提取、酶切、连接及转化均参照文献4方法进行。
11212 PCR 扩增参照文献5 方法及相关产品说明进行。
11213 重组DNA 的序列测定采用Sanger 双脱氧法在AB I 全自动测序仪上进行测序。
11214 含外源基因的表达质粒在大肠杆菌中的表达表达质粒转化大肠杆菌BL 21 (D E3) pL y sS ，挑
1 材料和方法
111 实验材料
11111 菌种和质粒大肠杆菌BL 21 (D E3) pL y sS Ξ 收稿日期:2000203213
国家“九五”科技攻关重点项目(96 - C02 - 01 - 03) 经费资助
选单菌落，接种于含氨苄青霉素(Ap )100 mg/ L 、氯
霉素34 mg/ L 的LB 培养液中, 37 ℃剧烈震荡至
OD 值为018 ～110 , 加入IP T G 至终浓度为1
mm ol/ L ，继续培养4 h ，离心收集菌体。
入片段与pJ N981Φ10 引导序列共一阅读框架的重
组质粒，获得含7 个单一融合克隆位点( E co R Ⅰ,
Sac Ⅰ, K p n Ⅰ, Sma Ⅰ,Ba m H Ⅰ, Sda Ⅰ, Hind Ⅲ) 及
可目视法筛选重组子的p E T3c 衍生物, 命名为
pJ N982 (图1) 。
213 应用pJ N982 表达Bb F GF
设计引物P Ⅲ、P Ⅳ从p U C2Bb F GF 上扩增
Bb F GF cDNA 全长序列, 并以正确阅读框架定向
插入载体pJ N982 的Ba m H Ⅰ、Hind Ⅲ位点, 获得
Bb F GF 融合表达质粒pJ N2Bb F GF ( 图2 ), 其部分
序列测定结果表明,L acZ 片段和Bb F GF cDNA 均
正确融入Φ10 引导序列之O R F ，达到预期目标。11215 表达产物纯化6 及生物活性7 检测表
达菌经超声破碎后, 离心收集上清; 上样于Bi o
Re x70 Resin 阳离子交换柱, 以含NaCl 的PB S 阶
段洗脱，收集活性组份；上样Heparin hyper D 肝素
亲合柱，洗脱，收集活性组份，去盐后适当稀释，以
M T T法检测活性。
2 结果
211 质粒pJ N981 的构建
以E co R Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切p E T3c , 回收
载体构建4907bp 大片段, Klenow 反应补平粘末端, 然后连
接，转化大肠杆菌D H5α，获得对E co R Ⅰ、Hind Ⅲ不
敏感的p E T3c 衍生物，命名为pJ N981 (图1) 。
Fig 2 C o n st r uctio n of plasmid pJ N2Bb F G F
214 b F GF 融合蛋白表达分析
pJ N2Bb F GF 转化表达宿主BL 21 ( D E3 )
pL ysS ，得工程菌BL [ pJ N2Bb F GF ，经IP T G 诱导
后，出现一条明显增粗的带及两条略浅的蛋白带
(图3) 。为进一步确认这三条蛋白带的性质，以兔
抗b F GF 抗血清作Wester n bl ot 分析( 图4) ，结果
表明，三条蛋白带均为b F GF ，经与图3 对照，目的
蛋白相对分子质量为18 000 ,19 500 ,21 000 。在目
的蛋白上方尚有部分轻微染的蛋白带，为交叉反
应结果，因为抗血清是以本室纯化的重组非融合
b F GF 免疫新西兰兔制备的多价抗血清，存在部分Fig 1 Co n st r uctio n of t h e exp r essio n vecto r pJ N982
212 质粒pJ N982 的构建
以p U C18 为模板, P Ⅰ、P Ⅱ为引物，扩增L acZ
N 末端94 个氨基酸的编码序列，该产物不仅含完
整的多克隆位点, 且其产物具α互补作用8 。对
PCR 产物和载体分别以Bgl Ⅱ和Ba m H Ⅰ酶切，利
用Bgl Ⅱ和Ba m H Ⅰ互为同尾酶的关系，将载体与
α
3 讨 论
本文构建的 pJ N982 是一种胞内表达型载体 ,
其表达外源基因水平适中 ，控制严谨 ; 并且由于克 隆位 点 增 加 及 L a cZ 片 段 特 有 的 α 互 补 能 力 , 使 pJ N982 具有部分克隆载体特征 ，应用范围更为广
泛 。
天然成熟 b F G F 是一非糖基化的单链多肽 ,
极适于以大肠杆菌/ 胞内型表达载体作为表达系
统 ，但由于 b F GF 基因结构以及密码子与大肠杆菌
密码子使用频率的差异9 , b F GF 基因很难在大肠
杆菌中进行高效表达 。本文在未人工合成 b F GF 基因全序列的前提下 , 将 b F G F 与载体 Φ102L a cZ
引导序列融合 ，改变其 N 端密码子结构 ，同时借助
载体的高效翻译起始机制 ，得到了产物可溶 、表达 量占菌体总蛋白 30104 %的 b F GF 表达质粒 ，初步 显示 pJ N982 在表达类似多肽生长因子上的广阔
应用前景 。
重组质粒 pJ N 2Bb F GF 转化宿主菌后 , 表达 3
种相对分子质量分别为 21 000 ,19 500 , 18 000 的 蛋白 ，这可能与 b F GF N 端不稳定性有关 。天然存 在的 b F GF N 端不稳定 ，对蛋白酶敏感 ，也受提取 过程的影响 ，其肽链长度从 108 个氨基酸到 154 个
11 Low molecul ar p rot ein mar kers :97 . 4 ,66 . 2 ,42 . 7 ,31 ,1414 kD 21BL [ pJ N 2Bb F GF / induced 31BL [ p J N 2Bb F G F / uninduced
Fig 3 SDS 2PA GE analysis of t h e bact eria lysat e (左)
1a 1BL [ pJ N 2Bb F GF / induced 2a 1BL [ p J N 2Bb F GF / uninduced
Fig 4 West ern b lo t analysis of t h e bact eria lysat e (右)
215 表达产物的纯化及生物活性测定
b F GF 表达产物经阳离子交换层析和肝素亲
合层析二步纯化后 , 在 SDS 2PA GE 上表现为一条 带 ( 图 5) ，经凝胶光密度扫描 ，纯度为 95 % 。活性 分析结果表明 ，重组 b F GF 有与参照品相似的促有 丝分裂活性曲线 (结果未显示) 。
10
氨基酸不等 。Knoerzer 等以 p U C12 表达 b F GF 融合蛋白时 , 获得的蛋白产物表现为两种分子质
量 ；我们构建的 p U C182Bb F GF 质粒的蛋白产物也
表现为两种分子质量形式 。本文中 ，重组 b F GF N 端融合了两种不同来源的片段 ，由于 b F GF 本身所 固有的不稳定性 ，加上外环境的影响 ，导致表达产 物为 3 种分子量的混合体 。重组 b F GF 经纯化后 , 蛋白产物为 1 种分子量 ，可能是因为 N 端不稳定 性受提取过程影响较大 ，在纯化过程中 ，融合片段 逐渐丢失所致 。对以上理论推导的直接试验证据 有待下一步进行 。
参 考 文 献
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11 Fractio n elut ed f ro m catio n exchange column 21 Fractio n elut ed f ro m heparin affinit y c olumn
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t h e t w o 2st ep p u rificatio n
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C onstrution and Appl ication of A pET 3c Derivative
Xio ng Sheng ,L i n J ian 1 , Ho ng An 1 , L i u J iesen 1 , Zhang L i ng 1 ,L i Zhiying 1 , Y ao Ruhua
( Dep a rt m e nt of B iotech nology , S out h Chi n a U ni ve r si t y o f Tech nology , Gu a n gz hou 510641 ;
1
B i oen gi nee r i n g Resea rch I nst i t ute of J i n a n U ni ve r si t y , Gu a n gz hou 510630)
Abstract The p ro karyote ex p r essi o n vecto r p E T 3c was m o d i f ied by dest r oying t h e E co R Ⅰ, Hind Ⅲ rest r ic 2
ti o n enzyme sites and inserting L acZ f ragment in t he Ba m H Ⅰ site 1 The derivat ive , na med as pJ N982 ,not o n 2 ly retained t he abilit y of p E T3c to e x p ress ex ogeno us gene efficiently but also had an increased number of f u 2
si o n cl o n ing sites f r o m 1 to 7 ,as well as gained t h e abilit y to identit y t h e reco mbinant by visual screening of
E 1 col i col o nies 1U sing pJ N982 , f used bovine basic fibro blast growt h f acto r ( B 2b
F GF ) was ex p ressed in
E 1 c ol i BL 21 (D E3) pL ysS to a level of 30104 % of total celluar p rotein 1 The target p rotein was p uri fi ed by
cati o n e xchange and heparin affinit y chro matograp hy f ro m t he super nant of bacteria lysate 1 It was fo und t h at t h e reco mbinant B 2b F GF had an identical bi o 2activit y wit h t h e standard b F G F 1 K ey Words p E T vecto r , Mult i ple cl o n ing sites , Visual screen , Bb F GF , Exp ressi o n
·信 息·
转基因猪皮研究获得重大突破
我国科研人员开发的“烧伤病人移植用转基因猪皮的制备及商品化研究”获得重大突破 ，于 1999 年 10 月通过了科技
部重点科技攻关生物医学工程专题论证 ，并获得资助 。该项具有自主知识产权的技术 ，是通过筛选低免疫原性 、低内源性 病毒水平 、皮肤构造与人类皮肤最为接近的猪品种或品系 ，通过将人的淋巴细胞系移植到猪体内或将猪皮移植于 T 、B 细胞 免疫缺陷 ，构建其皮内靶向可控性表达载体 ，并最终制备出满意的转基因猪皮 。这项技术经过小范围临床应用 ，效果满意 , 具有存活时间长 、抗排斥和免疫功能较强等特性 ，市场前景极为广阔 。
2001 - A - 1
英国研究能“饿死”癌细胞的药物
内病外治英国科研究人员首次完成的用药物“饿死”人体癌症组织的试验显示 ，用该方法可能成为癌症疾病的新途径 。这 种药物主成份是从非洲某种植物中分离出来的物质 。这种药物名为 C o m bret asOt atin ，病人服用它后可减少血液进入肿瘤 组织 ，导致癌细胞被“饿死”。这是在癌症研究方面首次发现药物能减少流向肿瘤组织的血液流量 ，该技术的实际应用将为 今后新的癌症疗法打开大门 。据悉 ，
这种新药的主要副作用是有些病人在服药 2 小时以内肿瘤部分出现短暂的疼痛 ，这可 能是血液流量受到干扰而造成的 。
2001 - A - 2
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