大鼠Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ基因重组慢病毒载体的构建与检测* 魏云艳，赵莉娟，孙蒙蒙，王瑾，于佳田，王德广*
（徐州医学院人体解剖学教研室，江苏徐州２２１００４）
摘要：目的克隆大鼠生长抑素ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ（ＳＳＴ）基因和神经元突触素Ｓｙｎａｐｓｉｎ（Ｓｙｎ１）的启动子序列，构建神经元特异性表达ＳＳＴ基因的重组慢病毒载体。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ法和ＰＣＲ法分别扩增ＳＳＴ基因和Ｓｙｎ１的
启动子序列，并将其克隆至重组慢病毒载体系统（Ｌｅｎｔｉ－ＥＧＦＰ），构建出以Ｓｙｎ１启动子序列为启动子、携带ＳＳＴ
基因的表达质粒Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ；再将该表达质粒与ｐＭＤＬ、ｐＲｅｖ和ｐＶＳＶＧ用磷酸钙共沉淀法共
转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，获得重组的慢病毒载体，将病毒注射入大鼠海马，检测ＥＧＦＰ和ＳＳＴ的表达效果。结果经 测序克隆的ＳＳＴ和Ｓｙｎ１启动子与ＧｅｎＢａｎｋ上的序列相比完全一致，并测得ＳＳＴ重组慢
病毒纯化后病毒滴度为１．５×１０９ＴＵ／ｍｌ，该病毒注射入海马可以转染神经元并表达ＳＳＴ。结论成功构建出以Ｓｙｎ１启动子序列为启动子，携带ＳＳＴ基因的重组慢病毒载体。
环氧大豆油生产工艺
关键词：生长抑素；神经元突触素启动子；慢病毒载体；构建
中图分类号：Ｑ７８４ 文献标志码：Ａ文章编号：１０００－２０６５（２０１５）１１－０７６４－０５
低频标签Construction and detection of a recombinant lentiviral
vector containing rat somatostatin gene
ＷＥＩＹｕｎｙａｎ，ＺＨＡＯＬｉｊｕａｎ，ＳＵＮＭｅｎｇｍｅｎｇ，ＷＡＮＧＪｉｎ，ＹＵＪｉａｔｉａｎ，ＷＡＮＧＤｅｇｕａｎｇ*
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｕｍａｎＡｎａｔｏｍｙ，ＸｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｘｕｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｓｕ２２１００４）
Abstract：ObjectiveＴｏｃｌｏｎｅｒａｔｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ（ＳＳＴ）ｇｅｎｅａｎｄａｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｓｙｎａｐｓｉｎ（Ｓｙｎ１）ｉｎｔｏａｌｅｎｔｉｖｉ
ｒａｌｖｅｃｔｏｒｔｏｅｘｐｒｅｓｓｎｅｕｒｏｎａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＳＳＴｇｅｎｅ．MethodsＳＳＴｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲａｎｄＰＣＲ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｎｄｔｈｅｎｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏａＬｅｎｔｉ－ＥＧＦＰｖｅｃｔｏｒ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄＬｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔａｎｔｐｌａｓｍｉｄａｎｄｔｈｒｅｅａｄｄｉｔｉｏｎａｌｐｌａｓｍｉｄｓｐＭＤＬ，ｐＲｅｖａｎｄｐＶＳＶＧｗｅｒｅｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｃａｌｃｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｔｏｏｂｔａｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｐａｒｔｉ－ｃｌｅｓ．Ｔｈｅｐａｃｋａｇｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰａｎｄＬｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＥＧＦＰ）ｗｅｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．ＴｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＥＧＦＰａｎｄＳＳＴｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＮｉｓｓｌｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ．ResultsＤＮＡｓｅｑｕｅｎ－ｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＳＳＴａｎｄＳｙｎ１ｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｏｓｅｉｎＧｅｎＢａｎｋ，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｐｒｏｄｕｃｅｄａｖｉｒａｌｔｉｔｅｒｏｆ１．５×１０９ＴＵ／ｍｌ．Ｔｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎｏｆＥＧＦＰａｎｄＳＳＴｇｅｎｅａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｉｎｔｏｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｎｅｕｒｏｎｓ．ConclusionＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｒａｔＳＳＴｇｅｎｅａｎｄＳｙｎ１ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．
Key words：ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ；ｓｙｎａｐｓｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ；ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
生长抑素（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ，ＳＳＴ）是由１１６个氨基酸的大分子肽裂解而来的十四肽，是作用比较广泛的一种神经激素，除下丘脑外，其他部位如大脑皮质、纹状体、杏仁核、海马以及脊髓等均有表达。ＳＳＴ通过与５个不同亚型的受体结合而产生不同的作用。人们在研究中发现，ＳＳＴ具有抗癫痫的作用，和其Ⅱ型受体结合，可以抑制突触前谷氨酸的释放进而抑制大鼠癫痫的发作[１]；也有研究表明大鼠海马内注射ＳＳＴ可以降低癫痫发作时ＣＡ１区产生的电信号[２]。随着人们对该疾病发病机制认识的深入以及分子生物学技术的发展，基因已成为目前癫痫领域最有前途的手段之一。
重组慢病毒（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）载体因其具有无神经毒性、较低免疫原性和高效、稳定、长期表达目的基因等优点，已成为具广泛应用前景的病毒载体工具之一。目前，已有人尝试用腺相关病毒作
*基金项目：江苏省教育厅课题（１４ＫＪＢ３１００２１）*通信作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｇｕａｎｇｗａｎｇ＠ｘｚｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
为载体将ＳＳＴ基因导入海马内癫痫，并有一定的疗效[３]。为降低ＳＳＴ在非神经细胞表达及影响，需使该基因的表达具有神经元特异性。神经元突触素Ｓｙｎａｐｓｉｎ（Ｓｙｎ１）启动子具有神经元特异性，可介导目的基因特异性地在神经元中表达[４－５]。因此，本实验构建以Ｓｙｎ１为启动子、神经元特异性表达
ＳＳＴ基因的重组慢病毒载体。
１ 材料和方法贴片变压器
１．１ 材料Ｔｒｉｚｏｌ试剂、血液／细胞／组织基因组提取试剂盒、质粒小提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、ＤＨ５ａ感受态细胞、ＤＮＡｍａｒｋｅｒ均购自北京天根生化科技有限公司；酚、氯仿、ＤＥＰＣ处理水、氨苄青霉素购自北京索莱宝公司；ＰＣＲ逆转录反应试剂盒购自ＴＯＹＯＢＯ公司；酵母提取粉、胰蛋白胨、琼脂粉购自广东环凯公司。ＰＣＲＰｒｅｍｉｘＴａｑ购自ＴａＫａＲａ公司；限制性内切酶ＭｌｕＩ、ＳａｃＩ－ＨＦ、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ、ＸｈｏＩ和Ｔ４连接酶均购自美国ＮＥＢ公司。慢病毒载体系统、ＨＥＫ２９３Ｔ细胞、胎生牛血清、ＤＭＥＭ培养液、青霉素和链霉素购自杭州擎科梓熙生物技术有限公司，引物合成及测序由杭州擎科梓熙生物技术有限公
司完成。
１．２ 方法
１．２．１ 大鼠脑组织总ＲＮＡ的提取雄性大鼠（购自徐州医学院实验动物中心）脑组织５０～１００ｍｇ，加１ｍｌＴｒｉｚｏｌ匀浆、冰上静置５ｍｉｎ；加入２００μｌ氯仿震荡１５ｓ、静置５ｍｉｎ，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取水相，加等体积异丙醇轻柔混匀１０次，－２０℃静置３０ｍｉｎ，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；弃上清，加入７５％乙醇１ｍｌ洗涤２次，４℃７５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；弃上清，晾干，加入ＤＥＰＣ处理水１００μｌ，５５～６０℃金属浴１０ｍｉｎ后轻柔吹吸使之充分溶解。１．２．２ 目的基因ＳＳＴ的获取将提取的总ＲＮＡ取１μｌ置于６５℃金属浴热变性５ｍｉｎ后，立即置于冰上，配制ＲＴ反应体系：５×ＲＴＢｕｆｆｅｒ２μｌ，ＲＴＥｎ－ｚｙｍｅＭｉｘ０．５μｌ，ＰｒｉｍｅｒＭｉｘ０．５μｌ，总ＲＮＡ１μｌ，加ＲＮａｓｅＦｒｅｅ的双蒸水至１０μｌ。３７℃进行逆转录反应１０ｍｉｎ后，９８℃５ｍｉｎ失活反转录酶，得到ｃＤ－ＮＡ。扩增目的基因ＳＳＴ：根据ＧｅｎＢａｎｋ数据库中提供的大鼠ＳＳＴ的基因序列，结合引物设计软件辅助设计用于克隆ＳＳＴ的引物，上游引物：５′ＡＴＡＴＴＡ－ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＣＧＴ３′（含ＥｃｏＲＩ酶切位点）和下游引物：５′ＡＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＡＡ－ＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＧ－ＴＣ３′（含ＸｈｏＩ酶切位点），冰上配制ＰＣＲ反应体系，ＰｒｅｍｉｘＴａｑ２５μｌ，ＰＣＲＦｏｒ－ｗａ
ｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）５μｌ，ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）５μｌ，ｃＤＮＡ１μｌ，超纯水补至５０μｌ，９５℃预变性１０ｍｉｎ，９５℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸５５ｓ，共３０个循环，７２℃充分延伸１０ｍｉｎ，４℃终止反应。ＰＣＲ产物经１％ＴＡＥ电泳后切胶回收，获得纯化的ＳＳＴ基因并进行测序。
１．２．３ 大鼠基因组的提取取大鼠肝脏３０ｍｇ剪碎匀浆，加２００μｌ蛋白酶Ｋ，５６℃金属浴直至组织完全溶解，使用组织基因组提取试剂盒进行基因组提取，最终用双蒸水溶解基因组，１％ＴＡＥ电泳检测提取的基因组。
１．２．４ 神经元突触素Ｓｙｎａｐｓｉｎ（Ｓｙｎ１）启动子序列的获取
１．２．４．１ 摸索Ｓｙｎ１启动子序列进行ＰＣＲ扩增时的退火温度根据已有研究提供的ＧｅｎＢａｎｋ号[６]查到大鼠Ｓｙｎ１的基因序列，设计并合成引物。上游引物：５′ＧＡＣＧＡＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＴＡＣＧＴＣ－ＣＡＧＡＧＣＡＧ３′（含ＭｌｕＩ酶切位点）和下游引物：５′ＴＡＴＡＡＴＴＡＴＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＧＧＣＡＧＴＧＧ－ＧＴＣＧ－ＧＴＧ３′（含ＳａｃＩ酶切位点），进行ＰＣＲ时选用６个梯度的退火温度：５０℃、５４℃、５８℃、６０℃、６２℃、６６℃，３％ＴＢＥ电泳选出最合适的退火温度。１．２．４．２ Ｓｙｎ１启动子序列进行ＰＣＲ扩增ＰＣＲ反应体系ＰｒｅｍｉｘＴａｑ２５μｌ，ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ
／Ｌ）５μｌ，ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）５μｌ，基因组１μｌ，超纯水补至５０μｌ。ＰＣＲ条件为９５℃预变性１０ｍｉｎ，９５℃变性３０ｓ，６０℃退火４０ｓ，７２℃延伸８０ｓ，３５个循环，７２℃充分延伸１０ｍｉｎ，４℃终止反应。ＰＣＲ产物经１％ＴＡＥ电泳后切胶回收，获得纯化的Ｓｙｎ１启动子序列。
１．２．５ 重组慢病毒骨架质粒Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ的构建及鉴定
１．２．５．１ 重组质粒Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＥＧＦＰ的构建及鉴定将测序正确的Ｓｙｎ１启动子序列和骨架质粒Ｌｅｎｔｉ－ＥＧＦＰ分别进行ＭｌｕＩ／ＳａｃＩ限制性内切酶双酶切后电泳并切胶回收，回收的Ｓｙｎ１启动子序列与载体以质量３∶１的比例用Ｔ４连接酶４℃过夜连接。５０μｌ体系的连接产物加到感受态细胞中，冰浴３０ｍｉｎ，金属浴４２℃热激４５ｓ，冰浴１０ｍｉｎ完成转化。转化后加１ｍｌ无抗生素的ＬＢ培养液３７℃，１ｈ活化，室温下１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，吸掉大部分上清液，用１００～２００μｌ剩余的培养基将细胞悬浮，涂布在氨苄青霉素平板上，３７℃正向放置１ｈ后倒置培养过夜。用牙
签挑单菌落至含氨苄青霉素的液体ＬＢ培养基中，３７℃培养过夜，质粒小提取后进行酶切和测序鉴定。１．２．５．２ 重组质粒Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ的构建及鉴定将测序正确的ＳＳＴ基因和重组质粒
Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＥＧＦＰ分别进行ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ限制性内切酶双酶切；同理，酶切产物进行连接、转化、活化、涂布、挑菌、ＬＢ培养以及质粒小提取后进行酶切和测序鉴定。
１．２．６ 重组慢病毒载体Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ的包装将ＨＥＫ２９３Ｔ细胞培养于１０ｃｍ培养皿中，待细胞生长达７０％左右融合度、状态良好时，将构建的表达质粒Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ（２７０μｇ）按比例与ｐＭＤＬ（１７６μｇ）、ｐＲｅｖ（９５μｇ）和ｐＶＳＶＧ（６８μｇ）四质粒混合至５０ｍｌ，加入１３．５ｍｌ０．２５ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２采用磷酸钙共转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，在３７℃、３％ＣＯ２孵育箱中培养４８～７２ｈ，可见细胞萎缩、脱落等细胞病态反应，说明有重组慢病毒载体生成，此时在荧光显微镜下可观察到绿荧光蛋白（ＧＦＰ）的表达情况，收集培养上清液和细胞，并将病毒细胞进行裂解，裂解后上清继续感染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，扩大培养重组慢病毒[７]。１．２．７ 重组慢病毒Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ的鉴定取２５％的蛋白酶Ｋ１μｌ，加入病毒液５μｌ，经５５℃反应１ｈ后，水浴煮沸５ｍｉｎ。取１μｌ所得产物做模板，分别使用ＳＳＴ引物和Ｓｙｎ１启动子引物进行ＰＣＲ，ＰＣＲ结束后电泳检测，其余病毒置于－８０℃冰箱保存[８]。
１．２．８ 重组慢病毒载体Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ的病毒滴度测定使用流式ＦＡＣＳ法检测病毒滴度，ＴＵ／μｌ＝（Ｐ×Ｎ／１００×Ｖ）×１／ＤＦ，Ｐ＝％ＧＦＰ＋ｃｅｌｌｓ，Ｎ＝转染细胞数＝１０５，Ｖ＝稀释后体积＝２０μｌ，ＤＦ＝稀释倍数＝１，１０－１，１０
－２等。最终测得Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－２Ａ－ＥＧＦＰ空载慢病毒滴度为２×１０９ＴＵ／ｍｌ，Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ慢病毒滴度为２×１０９ＴＵ／ｍｌ。
１．２．９重组慢病毒载体Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＥＧＦＰ及Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ的检测根据大鼠脑图谱确定海马ＣＡ１区坐标，（ＡＰ＝－３．５ｍｍ，ＭＬ＝±２ｍｍ，ＤＶ＝－２．８ｍｍ），分别注射３μｌＬｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＥＧＦＰ或Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ，手术４天后用４％多聚甲醛灌注取脑、后固定４ｈ、３０％蔗糖沉淀后３０μｍ冰冻切片。Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰＰ注射动物行Ｎｉｓｓｌ红荧光染；Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ注射动物的切片行ＳＳＴ免疫荧光染，切片使用１０％小牛血清封闭３０ｍｉｎ，兔抗ＳＳＴ（１∶１００，Ｓｉｇｍａ，ＳＡＢ４５０２８６１）４℃孵育４８ｈ，二抗使用ＴＲＩＴＣ驴抗兔（Ｊａｃｋｓｏｎ公司）室温孵育２ｈ，甘油封片，Ｏｌｙｍｐｕｓ荧光显微镜（ＢＸ４０）观察并照相。
２ 结果
２．１ ＳＳＴ目的基因的获得大鼠ＳＳＴ基因通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出约３８０ｂｐ的基因片段，电泳检测与预期结果一致（图１）；ＳＳＴ基因送公司测序，将测序报告与欲得到的目的序列相比对，显示获得ＳＳＴ基因片段序列完全正确。
２．２ Ｓｙｎ１启动子序列的获得大鼠Ｓｙｎ１启动子序列克隆时，其ＰＣＲ退火温度设置了６个梯度，ＰＣＲ后进行电泳，结果如图２。分析其结果可知除５０℃和５４℃外均可获得Ｓｙｎ１启动子，最终选定６０℃为其退火温度。ＰＣＲ扩增得到约１１３３ｂｐ的基因片段，ＰＣＲ产物电泳后得到的条带与预期结果一致（图
３）。
Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＩ；１、２．ＳＳＴ基因片段
图１ ＰＣＲ扩增ＳＳＴ
目的基因的电泳鉴定图
Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＩ；１～６分别为５０℃、５４℃、５８℃、６０℃、６２℃、６６℃
图２ Ｓｙｎ１启动子在不同退火温度的ＰＣＲ产物电泳鉴定图
Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＩ；１．Ｓｙｎ１启动子基因片段
图３ ＰＣＲ扩增Ｓｙｎ１启动子序列的电泳鉴定图
２．３ 重组表达质粒Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ的构建 见图４。２．４ 重组慢病毒载体和Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ的表达２．４．１ Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＥＧＦＰ空载慢病毒的表达 冰冻切片的红荧光Ｎｉｓｓｌ染显示，在注射空载慢病毒大鼠海马ＣＡ１部位明显的ＧＦＰ表达细胞，有明显的突起；Ｎｉｓｓｌ荧光染显示ＧＦＰ阳性细胞显示神经元的形态，白箭头示红的Ｎｉｓｓｌ和ＧＦＰ荧光重叠的神经元（图
５）。
图４ 重组表达质粒Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ
履带式陶瓷加热器
的构建图谱
Ａ．慢病毒载体注射；Ａ１．ＧＦＰ的表达；Ａ２．Ｎｉｓｓｌ荧光染；Ｂ．重组ＳＳＴ慢病毒注射；Ｂ１．ＧＦＰ的表达；Ｂ２．ＳＳＴ免疫荧光染；Ａ３和Ｂ３为叠合图像，白箭头标记ＧＦＰ绿荧光和红荧光重叠的神经元
图５ 重组慢病毒载体和Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ的表达
２．４．２ Ｌｅｎｔｉ－ｐＳｙｎ－ＳＳＴ－２Ａ－ＥＧＦＰ病毒的表达海马注射ＳＳＴ慢病毒后在海马ＣＡ１部位有ＧＦＰ阳性神经元，其绿荧光和ＳＳＴ阳性的红荧光有重叠（图５白箭头所示），说明外源基因ＳＳＴ大鼠脑内的神经元有表达。
３ 讨论
慢病毒是逆转录病毒家族的一个亚，可以高效率感染处于分裂期和非分裂期的细胞。使用慢病毒作为载体是近年来出现的一种新的基因转移工具，借助慢病毒可以将其携带的外源基因高效整合到宿主细胞基因组中，外源基因可以在宿主细胞中实现稳定长期的表达[９]。与其他逆转录病毒不同，慢病毒采用活化的细胞核输送途径转导非分裂、终末分化的细胞体（如神经细胞和造血细胞），是一种用途更广泛、更常用的工具，已经成为基因的首选。
ＳＳＴ是作用比较广泛的一种神经激素，通过与５个不同亚型的受体结合而产生不同的作用。目前，已有研究表明ＳＳＴ与其２型受体结合能抑制癫痫[１]，因此本实验构建ＳＳＴ基因载体，拟通过增加
ＳＳＴ在脑内某些特定脑区的表达量来癫痫。
神经元突触素（Ｓｙｎ１）是一种囊泡吸附蛋白，与突触的结构和功能密切相关，可特异性地分布在
突触前囊泡膜上，参与神经递质的释放，其基因的启动子序列具有神经元特异性，可介导目的基因特异性地在神经元中表达[４－５]。由于本实验要将生长抑素导入神经元内表达，因此我们选用Ｓｙｎ１的启动子序列来介导ＳＳＴ基因特异性地在神经元中表达。
消音工程本实验成功构建了以Ｓｙｎ１为启动子序列的表达ＳＳＴ基因的重组慢病毒载体，能够使目的基因ＳＳＴ在神经元中高效特异性地表达，为研究ＳＳＴ基因在相关疾病中的作用奠定基础。
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（６）：６４２－６４８．
收稿日期：２０１５－０６－０１ 修回日期：２０１５－１０－２５
本文编辑：程春开
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