电机转速传感器刘正伟;李慧敏;黄妙容;郭凯;王建丽;李延鹏;陈瑞爱
【摘 要】本研究以禽网状内皮增生症病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)囊膜糖蛋白(envelope,env)基因作为报告基因,定量检测不同启动子在体外的转录活性,为研发马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)活载体疫苗、选择适宜的启动子提供依据.本试验构建6个含不同启动子,且能表达env基因的重组质粒,并将构建好的重组质粒转染到鸡胚成纤维细胞中,通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量PCR检测不同启动子的表达转录水平.研究证明6种启动子均能使env基因在体外获得表达,且不同启动子的转录活性不同.比较发现MDV自身启动子相对其他组启动子的转录活性较弱,pec启动子的转录活性最强. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2014(041)002
【总页数】5页(P11-15)
【关键词】禽网状内皮增生症病毒;囊膜糖蛋白基因;启动子;活性分析
【作 者】刘正伟;李慧敏;黄妙容;郭凯;王建丽;李延鹏;陈瑞爱
【作者单位】华南农业大学,广东广州510642;华南农业大学,广东广州510642;广东大华农动物保健品股份有限公司,广东云浮527400;华南农业大学,广东广州510642;华南农业大学,广东广州510642;广东大华农动物保健品股份有限公司,广东云浮527400;华南农业大学,广东广州510642;广东大华农动物保健品股份有限公司,广东云浮527400
【正文语种】中 文
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【中图分类】Q78
疫苗是防治畜禽疾病的重要手段之一，随着分子生物学技术的日臻完善，以改造病毒核酸结构为手段的疫苗，如基因缺失株疫苗、插入突变株、病毒活载体疫苗等得到了极大的发展，其中病毒活载体疫苗以生产使用方便，价格低廉，且安全性、稳定性及免疫力较强等方面优势，成为研究的热点（沈美艳等，2001）。相对于其他病毒载体（如禽痘病毒、禽腺病毒、新城疫病毒等），鸡马立克氏病病毒（Marek's disease virus，MDV）可作为最有潜力的疫苗载体。但目前真正具有应用价值的MDV活载体疫苗却极为有限，最重要的原
因就是相对传统疫苗而言，病毒活载体疫苗的保护效力不是很理想。前期研究发现，在影响重组病毒保护力的关键因素中，当抗原基因确定后，适宜启动子的选择是影响重组病毒保护力的决定性因素之一（邱亚峰等，2006）。
启动子是一段位于结构基因5′端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性，启动子可控制特定基因在细胞内的表达水平。目前用于构建MDV重组疫苗的启动子很多，其中SV40和HCMV为常用的真核启动子（Sakaguchi等，1998）；gB启动子为 MDV gB基因的启动子，优点是其为MDV自身的启动子，属于同源启动子，缺点是转录活性较弱，但利用其构建的重组病毒，在含母源抗体的鸡中，却可对ND产生良好保护（Sonoda等，2000）；HCMV+gB为复合启动子，结构是在gB启动子前加入了HCMV的核心序列，既有MDV本身启动子的活性，又加入了HCMV的增强子序列；pec启动子是经过修饰的鸡β肌动蛋白启动子，其前端加入了HCMV的核心序列，研究结果表明，以MDV为载体的重组病毒中，其转录活性比HCMV要强得多，用其构建的重组病毒，外源基因的表达效果比 HCMV启动子好（Tsukamoto等，2002）；cag启动子（HCMV immediate enhancer/β-actin （CAG）promoter）结构与pec启动子相似，在真核细胞中的转录活性比HCMV启动子强得多（Niwa等，1991）。本试验构建了6种含线路转换器
不同启动子能表达REV囊膜糖蛋白（envelope，env）基因的重组质粒，分别比较它们的活性，为MDV活载体疫苗启动子的优化与筛选奠定了基础。
1 材料与方法
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1.1 菌株和质粒 穿刺菌（puc57-env、puc57-gBMCS-SV40pA、puc57-（HCMV+gB）-MCS-SV40pA、puc57-CAG-MCS-SV40pA、puc57-SV40-MCS-SV40pA）均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；pMD18-T载体、puc18载体和大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自TaKaRa公司；pcdna3.1（+）和puc57-pec-ndv（f）-SV40pA由华南动物疫病检测中心分子免疫学实验室保存。
1.2 主要试剂 限制性内切酶、DNA连接试剂盒、胶回收试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自TaKaRa公司；质粒抽提（包含去内毒素）试剂盒、总RNA提取试剂盒、胶纯化试剂盒均购自Omega公司；转染试剂盒、转染用培养基、荧光二抗FITC-Rabbit Anti-Mouse IgG 均购自Invitrogen 公司；普通DMEM培养基和血清购自Gbico公司；REV单抗由华南疫病检测中心分子免疫学实验室保存。
1.3 REVenv基因的扩增 根据在NCBI上查阅的REV env的序列，把序列重新进行优化，送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。挑菌液puc57-env摇菌，然后提取质粒，以其为模板扩增目的基因env（1761bp）。引物（表1）为puc57的通用引物，分别在上游加上酶切位点HindⅢ，下游加上酶切位点EcoRⅠ。PCR反应体系20μL：上、下游引物各1μL，Taq酶混合物10μL，模板1μL，ddH2O 7μL。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min。胶回收纯化目的片段，进行双酶切（HindⅢ、EcoRⅠ）鉴定，鉴定正确的产物-20℃保存备用。
表1 目的基因引物序列注：下划线部分为限制性酶切位点。基因 引物序列（5′→3′） 退火温度（℃）env 上游：ATTAAGCTTGTAAAACGACGGCCAGTG 56 pec下游：TTGGAATTCGGAAACAGCTATGACCATG上游：CGCGGTACCAGTTATTAATAGTAATC 55下游：TTAGTCGACCCTCTAGACGCGGTCAG env-SV40pA 上游：ATTGTCGACATGGACTGTCTGACTAATC下游：TCGAAGCTTTCTAGAGGATCCGAAAAAAC 56
1.4 含REVenv基因启动子表达载体的构建 把含有（gB、HCMV+gB、CAG、SV40）启动
子的菌液摇菌，质粒抽提，提取出的各质粒和pcdna3.1分别双酶切（HindⅢ、EcoRⅠ）后进行胶回收。回收的目的基因与酶切质粒进行连接。目的基因和载体回收产物以6∶1连接4h后，转化DH5α感受态细胞涂氨苄板培养12～16h后挑取单菌落摇菌，做阳性克隆的筛选。筛选出的菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序正确的分别命名为puc57-gB-env、puc57-（HCMV+gB）-env、puc57-CAG-env、puc57-SV40-env、pcdna3.1-HCMV-env。然后分别以puc57-pec-ndv（f）-SV40pA 和puc57-gB-env-SV40pA为模板设计2对引物（表1），扩增pec启动子和env-SV40pA序列，胶回收后分别双酶切，鉴定正确后按上述条件连接到puc18载体上，转化筛选阳性克隆送测序，测序正确的命名为puc18-pec-env。
载体构建1.5 间接免疫荧光（IFA）试验 鸡胚成纤维细胞（CEF），由孵化9～11日龄的SPF鸡胚按原代细胞制备的方法由华南动物疫病检测中心分子免疫学实验室制作。把构建好的质粒按Lipofectamine LTX＆Plus Reagent试剂盒说明书分别等量转染CEF细胞，48h后做IFA试验，荧光显微镜观察试验结果。
1.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
1.6.1 引物合成 根据目的基因序列和GenBank中公布的鸡的相关序列合成引物，引物序列见表2。
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表2 实时荧光定量PCR引物序列基因 GenBank登录号 引物序列（5′→3′） 产物大小（bp） 退火温度（℃）β-actin NM＿205518.1 上游：ATTGTCCACCGCAAATGCTTC下游：AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC 113 60 env 无 上游：CTGTGGAACGGTCTGAATGG下游：ATTTCGGTAGGCAGGGGTTT 188 60
1.6.2 标准曲线的制作 选取含SV40启动子的质粒转染CEF细胞48h后，提取Total RNA，反转录成cDNA，以其为模板，扩增相应的目的基因和内参基因。胶纯化后连接pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后筛选阳性质粒。筛选出的阳性质粒用分光光度计测其浓度，计算其拷贝数，然后10倍倍比稀释，稀释好的质粒做模板建立标准曲线。
1.6.3 不同启动子调控下的env基因的相对表达量比较 6种质粒等量转染CEF 2代细胞，提取转染48h后的Total RNA，分光光度计测其浓度后，取质量相同的RNA反转录成cDNA，然后把cDNA都稀释10倍做模板备用。按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行反应。反应体系25μL：SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ12.5μL，上、下游引物各1μL，模板2μL，灭
菌水8.5μL。反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共45个循环；最后60～95℃跑熔解曲线。结果用2—△△Ct法进行处理。
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