In-Fusion⽆缝克隆的原理：基于插⼊⽚段和线性化载体末端15-20 bp的同源序列进⾏同源重组从⽽实现克隆的⽅法。 相片冲印ClonExpress技术是⼀种简单、快速并且⾼效的 DNA ⽆缝克隆技术，可将插⼊⽚段定向克隆⾄任意载体的任意位点。 ClonExpress®II 是新⼀代重组克隆试剂盒，包含增强的重组酶 Exnase®II。使⽤任意⽅式将载体进⾏线性化；在插⼊⽚段正 / 反向 PCR 引物 5’ 端引⼊线性化载体的末端序列，使得 PCR 产物 5’ 和 3’ 最末端分别带有和线性化载体两末端⼀致的序列 (15 bp-20 bp)。这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化载体按⼀定⽐例混合后，在Exnase®II 重组酶的催化下，仅需反应 30 min 即可进⾏转化，完成定向克隆，阳性率可达 95% 以上。
⼀、⽆缝克隆实验步骤
载体构建⑴ 线性化载体的制备
通过限制性核酸内切酶酶切载体使其线性化。
⑵ 插⼊⽚段的获得：
高浓除砂器
将线性化载体末端15 - 20 bp序列作为同源序列(蓝⾊和红⾊标记)，并将其分别添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5’端，以此对引物扩增得到带有同源序列的插⼊⽚段。
⑶ 重组反应：
将线性化载体和插⼊⽚段按⽐例混合，在重组酶Exnase 催化下，37℃反应30min即可完成重组反应，实现两线性化DNA的体外环化。
⑷ 转化感受态细胞：
废五金回收重组产物直接进⾏转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选。
⼆、⽆缝克隆实验的⽰意图
脚踏淋浴器基因敲除载体的构建流程.png厌氧胶能用于木材吗
同源重组原理.png
思维导图.png
Reference:
C112 CloneExpress Ⅱ One Step Cloning Kit
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议