884细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol lmmunol)2020 , 36(10) .论著•文章编号：1007 -8738(2020)10 -0884 -06黑素瘤相关抗原D4(MAGE_m)的生物信息学分析及真核表达载体的构建 李霞琼、邓芸婷\顾永耀高精洧\罗育h3，林文珍U3，谢小薰4，贺菽嘉K3* C广西医科大学基础医学院生物 化学与分子生物学教研室，广西南宁530021; 2广西医科大学第一附属医院病理科，广西南宁530021; 3广西高校生物分子医 学研究重点实验室，广西南宁530021; 4广西医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，广西南宁530021)
[摘要]目的分析黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)蛋白的理化性质、结构和功能，构建MAGE-D4真核表达载体。方法通 过生物信息学软件分析MAGE-D4蛋白的理化性质、结构和功能。以MAGE-D4/PMAL-C2原核重组质粒为模板，经PCR扩增、酶切后与PEGFP-C1真核表达质粒连接，转化大肠杆菌。连接产物经抗生素筛选、酶切、测序鉴定后，通过脂质体转染A549肺 癌细胞。结果MAGE-D4蛋白为不稳定亲水性蛋白，无跨膜结构和信号肤，二级结构以a螺旋为主，具有多个功能性修饰位 点，主要定位在细胞核。SLLLVILGV可能为MAGE-D4来源的HLA-A * 0201限制性T细胞表位。与MAGE-D4存在潜在相互作 用的前3位蛋白依次是染体成分4非结构维持蛋白同源物A (NSMCE4A)、T细胞识别的黑素瘤抗原1 ( MLAN A/MART-1)、黑素瘤B抗原5(BAGE5)。测序结果证实重组质粒含有MAGE-D4的全长编码序列（C D S)，能成功转染A549肺癌细胞。结论MAGE-D4蛋白为不稳定核蛋白，可通过与多种黑素瘤相关蛋白相互作用而发挥功能，其来源的短肽可能具有较强的免疫原性，并构建了 MAGE-D4真核表达载体。
[关键词]黑素瘤相关抗原D4(M A G E-D4)；生物信息学分析；P EG FP-C1
[中图分类号]R34, R318.04, Q518.2 [文献标志码]A
肿瘤因其有限的免疫原性会发生免疫逃逸，理 想的肿瘤抗原对肿瘤具有特异性并且不受免疫耐受 机制的影响，是肿瘤免疫的理想靶点[1<。Brnggen等[3]在1991年首次发现黑素瘤相关抗原 (melanoma-associated antigen，MAGE)，后来根据基 因结构及组织特异性表达模式不同，MAGE基因被 分为I类和11类[4]。MAGE家族的许多成员与肿瘤 发生发展的关系十分密切。MAGE-D4是Sasaki等[5]在胶质瘤中发现的I I类MAGE基因。研究表明，MAGE-D4在胶质瘤[6_7]、结直肠癌[8]、肝癌[9]、肺 癌[1°]等多种肿瘤中高表达，并且与肿瘤的淋巴结转 移及不良预后有关。在胶质瘤、结直肠癌、食道鱗癌 患者血清中可检测到MAGE-D4蛋白或其相应抗 体[7-8’"]。因此，MAGE-D4具有成为肿瘤辅助诊 断、预后评估和靶向标志物的潜能。然而，MAGE-D4作为一种肿瘤抗原，其生物学功能和表达 调控机制目前尚不明确。本研究通过生物信息学方 法对MAGE-D4蛋白的理化性质、结构、功能及其互 作蛋白进行了分析，通过DNA重组技术构建MAGE-D4真核表达载体并成功转染A549肺癌细胞，旨在为进一步阐明MAGE-D4在肿瘤发生发展中的作 用提供依据。1材料和方法
1.1材料
MAGE-D4/PMAL-C2原核重组质粒为广西高校 生物分子医学研究重点实验室前期构建保存。大肠 杆菌DH5a、PEGFP-C1载体也为该实验室保存。高保真DNA聚合酶购自生工生物工程（上海）股份有限 公司，PCR引物合成与测序服务也由该公司提供; Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金生物技术有限 公司；限制性核酸内切酶D、I和T4 DNA连 接酶购自TaKaRa公司；去内毒素质粒提取试剂盒购 自北京索莱宝科技有限公司；Lipofectamine IM2000购自Invitrogen公司；DNA凝胶回收试剂盒购自上海碧 云天生物技术公司。
采用蛋白质理化性质多参数分析工具ProtParam 分析蛋白质的基本理化性质，使用Hidden Markov模 型跨膜预测工具（transm em brane prediction using Hidden M arkov models,TMHMM)预测蛋白质跨膜区，蛋白质氨基酸残基的亲水和疏水性分析工具ProtScale分析蛋白质的疏水性，使用氨基酸序列信 号肽在线预测工具SingnalP预测蛋白质的信号肽剪 切位点，分子生物学序列分析软件DNAstar分析蛋白
收稿日期：2020 - 07-01；接受日期：2020 - 09-17
基金项目：广西一流学科（基础医学）建设项目（〇乂[00?-8嫩-20丨8)；广西自然科学基金（2017〇乂阳?人六198107)作者简介：李霞琼（1995-)，女，山西大同人，硕士研究生
T el：159****5358;E-mail：578255274@qq
*通讯作者，贺寂嘉，E-mail: *****************
10期李霞琼，等.黑素瘤相关抗原D4( MAGE-D4)的生物信息学分析及真核表达载体的构律885
高分子布鞋质的二级结构，蛋白质位点分析软件ScanProsite分 析蛋白质的功能性修饰位点，采用蛋白质亚细胞定位预现J工具(protein subcellular localization prediction tool n，p s o r t ii)预测蛋白质亚细胞定位，使用蛋白 质的主要组织相容性复合体（m ajor histocom patibility complex，MHC)表位预测软件SYFPEITHI和生物信 息学和分子分析单兀（bioinformatics&molecular analysis section,BIMAS)分析蛋白质的T细胞抗原表 位，蛋白质相互作用网络在线预测软件STRING预测 蛋白质的相互作用蛋白。
1.2方法
1.2.1 MAGE-D4的生物信息学分析通过生物信 息学相关软件分析MAGE-D4蛋白的基本理化性质和 结构，并预测MAGE-D4蛋白的信号肽剪切位点、蛋 白结构域和功能位点、亚细胞定位、T细胞抗原表位 以及相互作用蛋白等（表1)。
表1MAGE-D4生物信息学分析软件及网址
生物信息
学软件
网址分析内容
ProtParam http：//www. expasy. org/tools/protparam. html 基本理化性质TMHMM http：//www. cbs. dtu. dk/servicea/TMHMM/ 跨膜区
FrotScale ww w.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 亲疏水性
SingnalP /protscale/ 信号肽剪切位点DNAstar www.dnastar 二级结构ScanProsite http： //p rosite. exjiasy. tu^/cgi-bin/ p nisite/Scan V iew, cgi 功能性位点PSORTII psort.hgc.jp/form2.ht.ml 亚细胞定位
BIMAS http：//bim as. dcrt. nih. gov/molbio/hla_bind/ T 细胞抗原表位SYFPEITHI www.syfpeithi.de/
STRING________https：//string-dh. org_______________________________相互作用蛋U
1.2.2 PCR扩增 MAGE-D4 根据 MAGE-D4 mRNA 的全长编码序列（coding sequence,CDS)设计引物，上游引物加入Kozak序列GCCACC和BgZ I I酶切位 点，^'J%S^GAAGATCTGCCACCATGGCTG
AGG-GAAGCTTCAGCG-3'，下游引物加入I酶切位点，序列为5'-GGGGTACCTCAACGGTGCTGGATCCAG-GAG-3'。PCR反应参数设置：95丈预变性3 min，(951 变性 25 s、56T：退火 25 s、68丈延伸 1min)x 3〇个循环，68T延伸5 min。扩增结束后，通过10 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段，凝胶成像仪观察后 将目的条带胶回收纯化。
1.2.3目的片段、质粒的酶切和连接用6g/n、
I限制酶对pEGFP-C l质粒和PCR产物分别进行 双酶切。反应总体积为50其中10x缓冲液5i j l L, QuickCut II和分n I 各 1j j l L，DNA25 (x L，最后用ddH20补足体积，混匀后37弋孵育15min。酶切产 物纯化后进行连接，反应体系总体积为10p L，其中 酶切后质粒1p L，酶切后目的片段7 (xL，10x连接 酶缓冲液1 |x L，T4D N A连接酶（4〇0U/^L)1卟，161反应12~ 16h进行连接。1.2.4转化、筛选及鉴定使用大肠杆菌DH5a感 受态细胞，进行42T热休克法转化，涂板培养过夜。次日，随机挑取单菌落，37T过夜摇菌提取质粒。经 琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增、SgZ H和I双酶切 三项鉴定均符合预期者，送至上海生工生物工程公 司进行测序。
1.2.5转染在24孔板中接种处于对数生长期的 A549肺癌细胞，当细胞汇合度为70%左右时，按 Lipofectamine™ 2000 操作说明书将MAGE-D4/ pEGFP-Cl质粒转染A549细胞，以转染PEGFP-C1 空质粒的A549细胞作为阴性对照。转染24 h后，采 用荧光显微镜观察并拍照。
2 结果
2.1MAGE-D4蛋白的理化性质
MAGE-D4蛋白分子式为
pfa喷涂共有741个氨基酸，相对分子质量（狄）为81 378, 理论等电点为6. 34，消光系数为99 600，不稳定指 数为44.77，脂肪指数为69_ 82, GRAVY值（总平均 亲水性）为-0.508，属于不稳定亲水性蛋白。亲疏 水性分析发现MAGE-D4蛋白在503 ~515氨基酸位 置有一个典型的疏水性区域。
2.2目的蛋白跨膜区域、信号肽及二级结构预测
MAGE-D4蛋白无跨膜螺旋，无信号肽，为非分 泌性蛋白。通过DNAstar软件对MAGE-D4蛋白二级 结构分析发现，ct螺旋的比例最高，为59. 6%，而 P折叠的比例最低，为4. 72%，并在第334 ~ 368位、450 ~480位氨基酸位置处存在2个卷曲螺旋区域 (图 1)〇
50 100 150 200 250 300 350 400 450500 550 600 650 700
M•丨•----B
»•■§••■■■---H
A t m a n s
■!«]. . G m w-fc b ta n
—M4M---1
G am rRatow
图1目的蛋白二级结构的预测结果
2.3修饰位点的分析
ScanProsite分析结果表明，MAGE-D4蛋白在 98 ~101、409 ~ 412位置有2个N-糖基化位点，350〜356处存在1个酪氨酸激酶磷酸化位点，在 692〜695位置有1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激 酶磷酸化位点，并且存在多个蛋白激酶C和酪蛋白 激酶n磷酸化位点（图2)。
886细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Immunol)2〇2〇，36(10)
「► 741aa
lOOaa 200aa 300aa 400aa 500aa 600aa 700aa
409-412
l i I 14-17 49-52 84-87 143-146
■ III I
288-29〇| 348-3481380-382 489-491|
291-293 499-501
319-322 358-361
692-695
I III
584-586 687-689 1721-723
695-697
(E (
648-651 658-661 711-714
■ MAGE-04 protein ■ W-gtycosylalion site
B c a m p- ao<3 cGMP-<3epen<j€ni prciein kinase pr»o$pi»cryiaticn sue
■ Protein lanase C ptKJspnoryiaticn site ■tonase pnospnorylaliori sue
| Casein kinase il pnospnoryiatior sue
图2 MAGE-D4蛋白功能性修饰位点分析
2.4目的蛋白HLA-A*0201限制性T细胞抗原表位分析
HLA-A*0201亚型在亚洲以及中国人中分布 频率较高，本研究通过SYFPEITHI和BIMAS两个生 物信息学软件联合分析，结果发现HLA-A * 0201限制性MAGE-D4抗原表位中预测分值最高的九肽序列 均为丝-亮-亮-亮-颜-异亮-亮-甘-缬（SLLLVILGV ) (图3)。下一步可以通过体外合成抗原肽，研究 MAGE-D4蛋白是否能诱导机体产生细胞毒性T淋巴 细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫反应。
BIMAS
SLLLVILGV (503-512)
ILSNEPWGL (68-77)
FLODLRKLI (541-550)
LLQERANKL (412-421)
VLWEALRKM (523-532)
YTLEKKFGI (460-469)
TLTSFDIHI (47-56) ■
RLLGKTKDT (491-500) ■
VLCLPPRNV (402-411) ■
CLPPRNVTL (404-413) ■2.S MAGE-D4蛋白亚细胞定位和互作蛋白的预测
MAGE-D4蛋白在第250氨基酸位置存在序列为 脯-精-脯-赖-精-脯-丙（PRPKRPA)的核定位信号paf7，
PSORT H分析结果提示MAGE-D4蛋白主要位 于细胞核，其次为细胞质。通过STRING软件对 MAGE-D4的互作蛋白进行预测发现，得分最高的十 个蛋白依次是染体成分4非结构维持蛋白同源物A (non-structural maintenance of chrom osom es element 4 hom olog A，NSMCE4A)、T细胞识别的黑素瘤抗原1 (m elanom a antigen recognized by T-cells 1, MLANA/ MART-1)、黑素瘤 B抗原 5 (B m elanom a antigen5 , BAGE5 )、前黑素体蛋白（prem elanosom e protein，PMEL)、G抗原 1(G antigen 1，GAGE1)、癌-睾丸抗 原 1A (cancer/testis antigen 1A,CTAG1A)、癌-辜丸 抗原 1B(cancer/testis antigen 1B，CTAG1B)、EP300 相互作用分化抑制因子3 (EP300- interacting inhibitor of differentiation 3，EID3:)、黑素瘤抗原 D 家族 4B (melanoma antigen family D，4B，MAGE-D4B)、酷氧 酸酶（tyrosinase，TYR )，其中MAGE-D4 与NSMCE4A、EID3的互作关系已有实验证实（图4)。
100 200 300400 500 600 700图4 MAGE-D4互作蛋白网络
SLLLVILGV (503-512)
SLGPGLRIL (61-70)
LLQERANKL (412-421)
RLSLLLVIL (501-510)
CLPPRNVTL (404-413)
LLLVILGVI (504-513)
VLAQTLVEA (80-89)
ILSNHPWF.L (68-77)
ALQLDPETL (88-97)
IIERATYTL (454-463)
SYFPEITHI
I分值
图3目的蛋白HLA-A * 0201限制性T细胞抗原表位分析2.6 MAGE-D4/pEGFP-C l真核表达质粒的构建与鉴定
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后可见大小为2248 bP的条带（图5)，说明目的基因扩增成功。MAGE-D4扩增产物酶切后与质粒连接，经转化、卡 那霉素筛选后得到MAGE-D4/PEGFP-C1重组质粒。对重组
质粒进行酶切鉴定，可见符合预期大小的两条 DNA条带（图6)，表明MAGE-D4已经与pEGFP-C l质 粒重组，而且方向正确。将重组质粒送公司进行测 序，经BLAST比对证实插入片段的碱基序列与目的 基因的cDNA完全一致，说明MAGE-D4真核表达质
粒构建成功。
10期李霞琼，等.黑素瘤相关抗原D4( MAGE-D4)的生物信息学分析及真核表达载体的构律887
M: DNA marker; 1: MAGE-D4 PCR 产物.
图5 MAGE-D4扩增产物电泳结果
M: DNA marker; 1: pEGFP-Cl 质粒；2: MAGE-D4/pEGFP-Cl 质粒；3: I I、I 双酶切 MAGE-D4/pEGFP-Cl 质粒.
图6 MAGE-D4重组质粒酶切鉴定电泳结果
2.7 MAGE-D4重组质粒转染A549肺癌细胞
MAGE-D4重组质粒通过脂质体转染A549细胞，24 h后在荧光显微镜下观察，空质粒转染组和重组 质粒转染组均出现绿荧光，细胞生长状态良好 (图7)，说明MAGE-D4重组质粒能成功转染A549 细胞，为下一步筛选稳定表达MAGE-D4的肺癌细胞 株奠定了基础。
图7转染后的A549细胞（xlOO)3讨论
研究表明MAGE-D4与肿瘤的临床病理特征相 关，基因过表达及沉默实验发现MAGE-D4可以促进 肿瘤细胞的生长增殖，增强其侵袭和迁移能力，提示 MAGE-D4可能与恶性肿瘤的发生发展密切相关。〇1〇叫等[12]报道口腔鳞癌细胞过表达MAGE-D4基 因时，肿瘤细胞的增殖和迁移能力增强，而凋亡则受 到抑制，同时MAGE-D4表达增高的口腔鳞癌患者更 易出现淋巴结转移和不良预后。（^^〜。等^^发现 MAGE-D4表达与乳腺癌的分级、淋巴结转移、复发 时间和生存期有关，可能通过影响信号转子与转录激活子 3 (signal transducer and activator of transcription3，STAT3 )、核因子KBp65 (nuclear factor-KB P65, NF-K BP65)的活性及诱导上皮间质转 化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)促进肿瘤细胞侵袭。1^〇等[14]发现\^0£-04可作为食管鳞癌独立的预后因素，MAGE-D4基因敲除后肿瘤细胞 的增殖和迁移能力明显受到抑制。有研究表明 MAGE-D4高表达与肺癌组织的高增殖活性及低分化 显著相关[15]。本课题组前期也发现MAGE-D4 mRNA和蛋白在肺癌组织中高表达，而且MAGE-D4 的表达与其基因启动子甲基化程度呈负相关[1°’16]。MAGE-D4还可以诱导机体发生细胞免疫反应，在胶 质瘤、口腔鳞癌中证实MAGE-D4来源的短肽具有免 疫原性，可以诱发特异性CTL反应[nM8]。上述研究 结果说明MAGE-D4可作为肿瘤预后评估和免疫 的分子标志物。
本研究通过生物信息学对MAGE-D4蛋白的功能 进行了分析。MAGE-D4蛋白具有多个蛋白激酶磷酸 化位点和2个N-糖基化位点，蛋白质磷酸化和去磷 酸化的可逆反应是细胞生物学效应及信号通路的重 要调控机制，组蛋白磷酸化可以促进结肠癌细胞自 唾 19，膜岛素受体底物 1(insulin receptor substrate
1，IRS-1)去磷酸化可以促进肺癌细胞侵袭和集落形 成[2°]。蛋白质糖基化则通常与细胞黏附与识别有 关，细胞表面蛋白质末端基序的糖基化改变与肿瘤 细胞的侵袭能力增强有关。糖基化的上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)可通过诱导EMT促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移[21]。活化白细胞黏附分子（activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)的N-糖基化可以促进卵巢癌细胞 的聚集，并影响患者的预后[22]。在预测的MAGE-D4 互作蛋白中，PMEL、MLANA、BAGE5、CTAG1B 等 均属于黑素瘤相关蛋白，其中PMEL是形成黑素体 必要的黑素细胞特异性糖蛋白，沉默PMEL
基因可
888细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol lmmun〇l)2020, 36( 10)
抑制黑素瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋 亡[23];MLANA是一种主要的黑素细胞分化抗原，该 蛋白被认为是诊断鼻腔和其他黏膜黑素瘤的标志 物[24]；肿瘤抗原CTAG1B的高表达与膀胱癌的不良 组织病理学特征有关[25]。EID3和NSMCE4A是组成 SMC5-SMC6复合体的蛋白，参与细胞的DNA损伤反 应以及染体的同源重组修复，MAGE蛋白可通过其 特有的染体成分非结构维持蛋白3( _-structural m aintenance of chrom osom es elem ent3，Nse3)/MAGE结合区介导与EID3相互作用[26_27]，并且EID3可作为 预测多形性胶质母细胞瘤患者预后的独立因素[28]。根据上述MAGE-D4蛋白功能性位点及互作蛋白的预 测结果，提示其可能通过化学修饰调节、信号转导、DNA损伤修复及细胞黏附与识别等方面参与肿瘤的 发生和进展D
本研究构建真核表达载体时，首先在引物序列 中MAGE-D4起始密码前加人了Kozak序列 GCCACC，Kozak序列能与翻译起始因子结合，其所 在位置距离起始密码子越近则启动翻译的效果越好，能实现目的蛋白的高效表达；其次由于MAGE-D4基 因的CDS片段较长，为降低碱基错配几率，PCR时选用了高保真DNA聚合酶，该酶具有3'—5'核酸外 切酶活性，在碱基发生错配时能进行及时的校正，以保证DNA扩增产物与模板保持高度的一致性；最后 在载体的选择上，pEGFP-C l质粒具有复制快速、方
便目的基因的插入、易筛选、对细胞无毒性等优点，其携带的绿突光蛋白（sreen fluorescent protein，GFP)基因位于多克隆位点的上游并可表达GFP，不仅便于观察质粒转染细胞的效率，而且与目的基因 的表达互不干扰。本实验结果表明重组质粒可转染 A549肺癌细胞并表达GFP，说明MAGE-W/pEGFP-Cl 真核表达质粒构建成功。
本研究对MAGE-D4蛋白的理化性质及结构、互相作用蛋白和T细胞抗原表位进行了生物信息学分 析，结果提示MAGE-D4蛋白在肿瘤发生发展中可能 承担重要角，可能是肿瘤免疫的候选靶分子；成功构建了 MAGE-D4/PEGFP-C1真核表达载体，为深入研究MAGE-D4的生物学功能及其在肿瘤中的 作用机制提供了依据。
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