如果选择的⽅法不对，或者细胞株不对，不同的细胞株做基因敲除细胞系的改造会有什么变化呢？筛选细胞是基因敲除细胞成败的重要环节！如果没有正确的⽅法那么基因敲除的细胞株⼯作就不能顺利的进⾏，⾸先要知道影响基因敲除细胞系的主要关键点是什么？其次是要了解和熟悉具体的实验流程和实验步骤，让⾃⼰轻松的完成基因敲除细胞株的构建流程。 ⼀. 如何选择基因敲除的细胞：
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1.关键点：⽀原体污染在绝⼤部分的实验室⾥都不太被重视，如果⽀原体污染了细胞，则会导致细胞产⽣很多问题：如细胞的增殖问题，同时还会影响细胞的代谢，产⽣的数据也会有很⼤的误差，所以在实验室⾥的技术⼈员都需要⾮常重视。
2.检测⽅法有两种：细胞培养和PCR鉴定。
3.基因敲除的优势：克隆形成率⾼，敲除效率⾼，细胞容易增殖，但是有⼀个例外就算是做了细胞基因敲除株的构建，也⽆法获得基因敲除的单克隆细胞，那就是没有多基因的问题；染⾊体不突变；难增殖的细胞；细胞的数量有限；做基因敲除细胞株难以得到纯合⼦敲除的细胞系的原因就是克隆的拷贝数太多。
4具体原因：只能是肿瘤细胞系，不能是永⽣细胞系，往往很多永⽣细胞系做起来都⽐较有挑战性，当在做基因敲除细胞株时，如果敲除效率是x，则拷贝数是n，那么纯合敲除的效率就是：x^n，可见效果就不显著了。
单向排水阀⼆. 基因敲除细胞系的敲除⽅法：
高纯球形硅微粉1.建议⾸选：如果只是做常规的移码敲除，那么⼀个细胞⾥⾯只有2个基因位点，是很难保证两个基因位点是⼀样的移码，所以得到移码的数据也不同，当你在鉴定测序看图的时候就没有那么清晰，所以，选择⽚段敲除是⼀个较为有效的办法。
2.关键点：移码敲除在很多时候并不彻底，会在后续的实验中出现Western Blot的问题，出现神秘的条带，⼤⽚段的基因敲除是⼏kb的缺失，mRNA就没有⽬的蛋⽩的转录，Western Blot问题也解决了，鉴定敲除⽅法：纯合敲除细胞系，⽐移码敲除效率更⾼。
3.如何判断是⼤⽚段敲除的细胞系：主要是通过⽬的基因⽚段对PCR扩增的⽅式判断。链式运输机
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三. 细胞周期分析：
1.如果采⽤病毒法，构建载体，病毒包装，转染细胞，细胞筛选，单克隆，PCR鉴定/测序，扩增——⼀个步骤都不能少。
2.使⽤转座⼦系统，构建好敲除质粒后，直接⽤质粒电转到细胞。
3.做基因敲除细胞株时，不要选择增殖太慢的，如果过表达量的Cas9蛋⽩+gRNA快速靶向，最快只需要5周时间，7-12周就可以得到纯合⼦细胞。
四.细胞拿到怎样⽤：
载体构建
如果是单克隆的细胞需要⼤量扩增，完全不⽤担⼼培养过程中蛋⽩恢复的问题，所有的细胞都必须经过严格测试，保证安全⽆污染，低内毒素可以直接⽤于动物体内实验，做代谢分析也能更加安⼼。如果移码突变，⼤量扩增可能会出现恢复（特别是敲除的蛋⽩对细胞增殖有优势的情况）细胞动物实验和代谢研究更放⼼。
五．诱导系统：
外源蛋⽩的诱导表达/沉默能很好⽐较本底和⼲预的区别，⾮常有⼒的诠释⽬的基因/蛋⽩的作⽤机理，特别适合研究⾃⾝具有毒性的蛋⽩，现已经被⼴泛使⽤。
Cas9x海星⽣物提供可诱导蛋⽩表达/基因敲除细胞株构建服务借助于真核表达载体/慢病毒系统，构建含有“开关”控制表达/沉默⽬的基因的质粒/病毒，通过电转/感染在各种细胞基因组上整合载体，利⽤抗⽣素筛选，得到可诱导的稳定细胞株，经过32代的稳定性QC检测，完成基因敲除细胞株的构建⼯作。
主要包含如下步骤:
1. 载体构建（诱导质粒载体、病毒载体）；
2. 转染；感染；电转；
3. “开关”诱导下⽬的蛋⽩初步检测；
4. 抗⽣素筛选；
5. “开关”⽬的蛋⽩再次检测（定性/半定量）；
6. 单克隆细胞株稳定性检测。
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