董伟欣;张月辰;张迎迎
【摘 要】为获得红荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)真核表达载体35S-pC1301-DsRED,利用PCR将瞬时表达载体PGDR上的全长DsRED扩增下来并用XbaⅠ和BamHⅠ酶切该片段,同时用相同的内切酶消化中间载体pBluescript SK(+),连接两片段并测序,将鉴定正确的DsRED用相同的内切酶切下并导入双元载体35S-pC1301,利用基因将正确质粒转染洋葱内表皮细胞瞬时表达DsRED.结果表明:35S-pC1301-DsRED真核表达载体已成功构建并在荧光共聚焦显微镜下呈现红光,即获得了可产生红荧光的35S-pC1301-DsRED载体,为今后植物目的基因定位提供了阳性对照,同时中间载体pBluescript SK(+)-DsRED的构建为今后植物目的基因定位提供了实验工具.
【期刊名称】《河北农业大学学报》
【年(卷),期】联合签名入口2010(033)003
【总页数】4页(P13-16)
【关键词】35S-pC1301-DsRED;表达载体;真核;构建;红荧光蛋白
【作 者】董伟欣;张月辰;张迎迎
【作者单位】河北农业大学,农学院,河北,保定,071001;中国科学院,上海植物生理生态研究所,上海,200032;河北农业大学,农学院,河北,保定,071001;中国科学院,上海植物生理生态研究所,上海,200032 载体构建【正文语种】中 文
【中图分类】Q3
红荧光蛋白RFP(Red fluorescent protein)是从印度太平洋与海葵相关的Discosomasp中分离得到的一种生物发光蛋白,它能在紫外线激发下发出红荧光。RFP的激发波长和发射波长较长,其最大激发波长为558 nm,最大发射波长为583 nm,且发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外[1]。
近年来,随着荧光蛋白多样性在红光谱范围内的发现[2],不同形式的DsRED相继用于细胞
分子生物学的研究[3-5]。这些蛋白可与GFP一起应用于双重标记实验或在转基因植物中作为一个单独的报告基因。报告基因(Reporter gene)技术是将一段顺时调控序列插入报告基因上游以控制报告基因的表达,从而直观地“报道”该顺时调控序列的表达调控以及与其相关信号转导通路的活动[6]。到目前为止,本实验室获得的红荧光蛋白是在PGDR载体上的DsRED[7],因PGDR为单元载体不能应用于转化真核生物材料,不利于直观形象的研究生物体内的基因功能,为此将DsRED导入中间载体和双元载体,这对于今后研究生物体内目的蛋白的功能提供了一种新的实验工具。
本研究旨在构建PGDR载体上的DsRED,用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切DsRED序列并导入双元载体35S-pC1301,最终构建成35S-pC1301-DsRED双元表达载体,并观察构建后的 35S-pC1301-DsRED在洋葱内表皮细胞中的瞬时表达情况,从而为进一步利用DsRED作为报告基因奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 pBluescript SK(+)质粒(Promega)35S-pC1301[8];DH5α(上海闪晶分子生物公司);含有DsRED片段的pGDR质粒[7]。
1.1.2 试剂和仪器 PCR引物(上海英潍捷基); Genclean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海捷瑞)、质粒抽提试剂盒(上海华舜);Marker、高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ、T4 DNA连接酶、T4连接buffer、氨苄霉素(AMP)及卡那霉素(Kan)等。 PCR 仪 (Eppendorf);电 泳仪 (Tanon EPS100);水平电泳槽(上海越磁电子科技有限公司);基因(Bio-Rad PDS-1000);激光共聚焦荧光显微镜(ZEISS LSM510 META)。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增及片段回收 运用DNASTAR软件根据DsRED序列设计引物,分别引入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点,所用引物:DsRED-F5′-TCTAGAGCCATGGCCTCCTCCGAGAA-3′; DsRED-R 5′-GGATCCT TACAGGAACA GGTGGTGGC-3′(下划线处为引入酶切位点 XbaⅠ和BamHⅠ)。以 pGDR质粒为模板进行 PCR, DsRED-F和DsRED-R扩增DsRED序列,琼脂
糖凝胶电泳鉴定正确后,Genclean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段,利用 XbaⅠ和BamHⅠ酶切该片段。试验中PCR的反应条件为: 94℃预变性为3 min,94℃变性30 s,58℃退火1 min,72℃廷伸45 s,共35个循环,72℃充分延伸10 min。PCR产物用内切酶消化3 h,酶切完成后用1%的Agarose凝胶电泳验证该酶切产物。
1.2.2 大肠杆菌培养 感受态细胞的转化,质粒提取,鉴定等按分子克隆实验指南2000版进行。
1.2.3 中间载体pBluescript SK(+)-DsRED的获得 利用T4 DNA连接酶将XbaⅠ和BamHⅠ消化的PCR产物与pBluescript SK(+)连接,4℃过夜后转化DH5α,在含AMP抗性的LB固体培养基平板上37℃培养16 h后有白菌落长出,挑取菌斑在含有AMP抗性的LB液体培养基内培养,其OD值约为1.2～1.4左右后,试剂盒提取质粒,用XbaⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后,送公司测序。
1.2.4 35S-pC1301-DsRED质粒的获得 将鉴定正确的pBluescript SK(+)载体上的DsRED序列与载体35S-pC1301同时用XbaⅠ和Bam HⅠ双酶切后利用T4 DNA连接酶对其进行连接,将上述连接产物转化DH5α,在含有Kan抗性的LB固体培养基平板上37℃培养16 h后有白菌落长出。挑取单菌落在含有Kan抗性的LB液体培养基内过夜培养,其OD值约为1.2～1.4左右
后,用试剂盒提取质粒,利用XbaⅠ和BamHⅠ进行双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳验证该酶切产物。
多聚磷酸盐>mcu解密
1.2.5 35S-pC1301-DsRED瞬时表达与观察 洋葱内表皮细胞中35S-pC1301-DsRED蛋白瞬时表达参照Collings等[9]。基因转化操作参照 Bio-Rad操作手册进行(PDS-1000/He),压力选择范围在1 100-1 300psi之间。样品在激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM510 META)上观察和拍照。激发波长设置:RFP 543 nm。
2 结果与分析
2.1 PGDR载体上目的片段DsRED的获得
在PGDR载体上DsRED序列的两端设计引物DsRED-F和DsRED-R,同时两条引物中分别引入酶切位点XbaⅠ和BamHⅠ。
以pGDR质粒为模板进行PCR,扩增出680 bp的DsRED片段,琼脂糖电泳鉴定正确后(图1), Genclean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段,将回收的PCR产物用XbaⅠ和BamHⅠ进行酶切,消化完全后,电泳并割胶回收目的片段。
图1 PGDR载体上PCR DsRED结果Fig.1 DSRED was amplified from transient expression vector PGDR by PCRDsRED=680 bp,MK=10 kb
遮蔽肩垫2.2 中间载体pBluescript SK(+)-DsRED的导入及鉴定
用XbaⅠ和BamHⅠ消化pBluescript SK(+)中间载体,消化完全后,同样利用试剂盒将切开的载体片段进行电泳回收(图2)。将用相同双酶切的PCR产物和pBluescript SK(+)中间载体利用T4 DNA连接酶进行连接,转化DH5α,获得含有目的片段的克隆,即pBluescript SK(+)-DsRED,利用XbaⅠ和BamHⅠ对其进行酶切验证(图2),两片段长度分别是pBluescript SK(+)3Kb和DsRED 680 bp左右,电泳验证酶切片段后,送公司测序(上海捷瑞),测序结果正确。
图2 SK(+)空载体酶切及重组载体SK(+)-DsRED酶切鉴定Fig.2 Intemediate vector pBluescript SK(+)and recombinant vector pBluescript SK(+)-DSRED were digested by XbaⅠand BamHⅡA:XbaⅠ和BamHⅠ双酶切空载体SK(+),SK(+)=3Kb;B:XbaⅠ和BamHⅠ双酶切重组载体SK(+)-DsRED,SK(+) +DsRED=3 Kb+680 bp,MK同上
2.3 双元载体35S-pC1301-DsRED的获得及鉴定
用XbaⅠ和 BamHⅠ消化双元载体35S-pC1301,通过凝胶电泳回收获得 11 Kb左右的DNA片段(图3),同时,将目的片段DsRED用相同的酶从鉴定正确的pBluescript SK(+)-DsRED上切下,利用T4 DNA连接酶进行连接,转化DH5α,获得含有目的片段的克隆,即35S-pC1301-DsRED,用XbaⅠ和BamHⅠ酶切验证,两片段长度分别是11 Kb左右和680 bp左右,电泳验证酶切片段正确(图3),即获得了35S-pC1301-DsRED双元载体。
图3 双元载体35S-pC1301酶切及重组载体35S-pC1301-DsRED酶切鉴定Fig.3 Binary vector 35S-pC1301 and recombinant vector 35S-pC1301-DsRED were digested by XbaⅠand BamHⅠ.A:XbaⅠ和BamHⅠ双酶切双元载体35S-pC1301,35S-pC1301=11 Kb;B:XbaⅠ和BamHⅠ双酶切重组载体35S-pC1301-DsRED,35S-pC1301+DsRED=11 Kb+680 bp,M K同上
2.4 转染洋葱细胞后35S-pC1301-DsRED的瞬时表达
>恶劣的太阳
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