狭义基因工程的基本五步：切、接、转、增、检。
a.从供体中分离出基因组DNA ，用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。 b.接，用DNA连接酶含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成DNA重组分子。 c.转，借助细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。
d.增，短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。
e.检，筛选和鉴定经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。 2基因工程的基本原理
a．利用载体DNA在受体细胞中独立于染体DNA而自主复制的特性，将外源基因育载体重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中拷贝数，以提高其宏观表达水平。涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传的遗传学原理。
b．筛选、修饰、重组启动子、增强子、操作子和终止子等基因转录调控原件，并将这些原件与外源基因精确剪切，通过强化外源基因的转录水平而提高其表达水平。
c．选择、修饰、重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控后原件，强化受体细胞中目标蛋白的生物合成过程。（以上两步涉及基因表达调控的分子生物学原理。）
d．在强化并维持基因工程菌（细胞）最佳生产效能的基础上，从工程菌大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微生物反应器的增值熟读和最终数量，也是提高外源基因表达产物产量的重要环节。
3基因工程中载体的功能是什么？一个理想的载体具有哪些特征？
(1).载体有三大功能：a.为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。b.为外源基因提供在受体细胞中复制或整合能力。c.为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。
(2).理想载体所具有的4个特点：a.具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体入细胞的效率。b.具有与特定受体细胞相适应的复制位点和整合位点，使得外源基因在受体细胞中稳定的遗传。c.具有多种单一的核算内切酶识别切割位点，以便于外源基因
的剪接插入。d.具有合适的选择性标记，以便于重组DNA分子的检测。
4在构建质粒载体时，质粒的基本特征中哪些被利用？哪些通常被除去？为什么？
（1）质粒的基本特征：a。自主复制性，质粒能够利用宿主细胞的DNA复制系统独立的复制并保持恒定遗传，由必要区和非必要区组成。必要区含复制相关的基因，决定质粒的存活与复制功能。非必要区主要含抗性、毒素分泌、复杂物质降解等性状的基因，影响细胞表型。b.可扩增性，有有严谨型和松弛型两种复制形式。c.不相容性，不同的质粒能稳定的存在同一受体细胞内称为质粒的不相容。d.可传递性，质粒在一系列特定转移基因控制下，可以通过结合作用在宿主细胞间进行自然传递。e.自带有遗传标记性状。
（2）理想的质粒载体所具有的特点：a.能高效的导入受体细胞。b.具有完整的复制子功能和整合位点，能在受体细胞中稳定的遗传。C.具有易被检测的合适的选择性标记。d.具有多种限制性内切酶的单一识别位点。e.具有尽可能小的分子质量。f.属于松弛型复制。g.属于非传递型质粒。
5.质粒载体构建的基本思路？
a.删除DNA非必要区域，尽量缩小质粒的相对分子质量，提高外源DNA片段的装载量。
b.灭活不需要的基因（如为提高拷贝数而灭活的质粒表达的负调控基因，为防重组质粒扩散污染而灭活mob基因。
c.添加易于识别的选择标记基因（最好具有双重或多重选择标记）。
e.在选择性标记基因内引入多酶切位点，即多聚接头，以便于外源基因的重组。
f.根据外源基因克隆的不同要求添加特定的调控原件或用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。
6不同质粒载体的用途
a.克隆质粒载体，用于克隆和扩增外源基因，含有氯霉素可扩增的松弛型复制结构，如pBR系列，质粒拷贝数可达数千个/cell。
b.穿梭质粒载体，含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。
c.表达质粒载体，在多克隆位点的上下游有转录较高的启动子，合适的核糖体聚合位点（SD序列）以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点的任何外源基因都能在受体细胞中高效表达。
d.整合质粒载体，含有整合酶基因以及整合特异性的位点序列，其上插入的外源基因在受体细胞中能够准确的重组到宿主染体DNA的特定位点上。
载体构建
e.测序质粒载体，含有测序通用引物互补序列和多酶接头
f.探针质粒载体，含有报告基因，用于筛选克隆基因的表达调控原件。
g．温敏质粒载体，在不同温度下表现出整合、拷贝数等不同性质
7λ-噬菌体载体的构建的基本步骤
a.缩短野生型λ-DNA的长度，提高外源DNA片段的有效装载量。
b.删除重复的酶切位点，引入单一的多酶切位点，构建多克隆位点。
锰氧化物
c.灭活与列解周期有关的基因，使λ-DNA载体只能在特殊的条件下感染裂解宿主细胞，避免生物污染。
e.加入合适的选择标记基因，以便于重组噬菌体的检测。隔声工程
f．根据需要构建密码子的琥珀突变体。
8比较质粒载体和病毒载体的基本特征
（1）λ-DNA的优点
a．λ-DNA可经过体外包装生成能高效转染E.coli细胞的噬菌体颗粒。
提金工艺
b．λ-DNA载体的装载量远大于质粒，可以达25kb。
c．重组λ-DNA分子的筛选和提取较为方便。
d．λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。
9了解基因工程中常用工具酶的功能和用途
a．核酸酶—切开、切除或降解核酸分子的酶。
煮面炉b．连接酶—将两个DNA分子连接起来的酶。
c．聚合酶—催化DNA复制和修复DNA分子损伤的酶。
d．修饰酶—在DNA分子上去除或添加化学基团的酶。
e．拓扑异构酶—向共价闭合环状DNA分子中引入或消除超螺旋的 酶。
10不同末端连接的方法，比较平头末端和粘性连接的效率，解释产生差异的原因
（1）四种不同的连接方法
a．两种DNA分子都具有5’黏性末端，在连接反应前两种DNA片段都用Klenow酶补平，然后进行连接，因此产生的重组分子多出四个碱基。
b．两种DNA分子都具有3’黏性末端，可以用T4—DNA聚合酶将这两种DNA的3’黏性末端切除，形成平头末端后在连接，所产生的重组DNA分子少了4个碱基对。
c．一种DNA分子具有3’黏性末端，另一种DNA分子携带5’黏性末端。则3’黏性末端用T4—DNA聚合酶修平，而5’端用Klenow酶补平，因此重组的DNA分子并没有改变碱基数目。
d．两种DNA分子都具有不同的两个黏性末端，通常先用Klenow酶补平一种DNA分子的5’黏性末端，再用T4—DNA聚合酶切平3’黏性末端的另一端。
（2）DNA黏性末端的连接在退火条件下属于分子内部作用，而平头连接为分子间反应。因为平头末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平头末端的3’羟基或5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平头末端的连接速度要比黏性末端的慢10——100倍。
11了解重组率和转化率的概念及其影响因素和其在基因工程中的用途
（1）转化率的影响因素：
a．载体及DNA重组分子方面，载体本身的性质、载体的空间构象、插入片段的大小
b．受体细胞方面，受体细胞与载体想匹配。
c．转化操作方面，受体细胞的预处理（影响最大）、供受体的比例（50-100ngDNA对应1
08碳油受体细胞）、转化方法（Ca2+>原生质体转化法>λ-DNA转染>电穿孔法）。
（2）转化率的用途：利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验的规模。
12比较转化子筛选和重组子鉴定的三种基本策略的优缺点。
（1）基于载体遗传标记的筛选与鉴定
a．原理，利用载体携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子（但一般不能区分目标与非目标重组子）。
b．第一轮选择时，培养基施加合适的选择压力，使转化子能显示出(菌落或噬菌斑)，非转化子不显示出。
c．第二轮选择(通常原位影印到第二轮的板上进行)时，视标记基因的性质进行正选择或负选择，从转化子中筛选出重组子。
（2）基于克隆片段序列的筛选与鉴定
a．原理，根据被克隆基因(或DNA片段)的部分序列来筛选鉴定目标重组子，可作为目标重组子的一个证据。
b．PCR鉴定法、菌落原位杂交法、限制性酶切图谱法、亚克隆法、DNA序列测定法
（3）基于外源基因表达产物的筛选与鉴定
a．通过鉴定基因表达的蛋白质产物的结构或功能来筛选和鉴定目标重组子。因此重组子必须含有相应的表达元件，并且受体细胞本身不产生具有相同结构和功能的蛋白质。
b．蛋白质生物功能检测法、放射免疫原位检测法、蛋白凝胶电泳检测法。
13了解目前常用的分离克隆目标基因的表达方法原理及适用范围
单一目的基因克隆的获得方法主要有两类：构建基因文库，用适当的方法从文库中筛选后的目标基因的重组克隆；用PCR技术合成单一的目标基因，在构建克隆进行表达。
主要方法：鸟法、cDNA法、PCR扩增法、化学合成法、基因文库的构建
3.1 在载体水平上影响大肠杆菌细胞中外源基因高效表达的的因素有哪些？
a．启动子，大肠杆菌及噬菌体的启动子是控制外源基因转录的重要元件，mRNA的生成速率与启动子的强弱密切相关，而转录又在很大程度上影响蛋白质的合成。
b．终止子，外源基因在强的启动子的介导下表达容易发生转录过头的现象，形成长短不一的mRNA混合物。过长的产物不仅影响mRNA的翻译效率，也使外源基因的转录速度大幅度降低。
c．SD序列，外源基因在大肠杆菌中高效表达不仅取决于转录启动频率，还与mRNA的翻译起始效率密切相关。mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译起始效率就越高，而这种结合程度取决于SD序列与16rRNA的碱基互补性。
d．密码子，基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱性。
e．质粒的拷贝数，常使用的表达型质粒在E.coli细胞中的拷贝数可达数百到上千，质粒扩增通常发生在对数生长期内。但质粒的过度增殖以及随后目标基因的高效表达也会影响受体细胞的生长代谢，导致重组质粒的不稳定性以及外源目标基因宏观表达水平的下降。
2. E.coli基因工程菌的构建策略组要有哪些？其基本特点如何？
基本策略有：包涵体型异源蛋白的表达、分泌型异源蛋白的表达、融合型异源蛋白的表达、寡聚型异源蛋白的表达、整合型异源蛋白的表达、蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
a．包涵体型异源蛋白的表达，大部分存在于细胞质中，基本上由蛋白质组成，其中大部分是外源基因表达的产物，具有正确的氨基酸序列，但空间构象往往是错的因此没有生物活性。其优缺点：能简化外源基因表达产物的分离操作，能在一定程度上保持表达产物结构的稳定。但包涵体纯化过程中，重组蛋白收率有一定损失，且需要复性过程来恢复重组蛋白的天然活性结构。
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