收稿日期：2009-03-11
基金项目：黑龙江省生物菌种资源共享平台建设（KT05A400-1）
作者简介：宋庆凤（1983-），女，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。
*通讯作者：李杰，副教授，硕士生导师，研究方向为植物分子遗传学与基因工程。E-mail:lijie_neau@126 宋庆凤，暴立娟，李
杰*
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨
150030）
摘要：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系
统的表达载体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP 启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX ，成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPH α。并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn 2为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现xyn 2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU 替换载体上原有的α-Factor 信号肽，结果表明，INU 信号肽能够有效引导XYNII 的分泌。 关键词：毕赤酵母；表达载体；GAP 启动子；INU 信号肽中图分类号：
文献标识码：A
文章编号：1005－9369（2009）07－0055－05
Construction and probation of neotype secreting expression vectors for Pichia pastoris /SONG Qingfeng,BAO Lijuan,LI Jie （College of Life Sciences,Northeast Agricul-tural Unive rsity,Harbin 150030,China )
永磁电机设计
Abstract:Pichia pastor is is one of the foreign protein expression system which has been widely
used.The expression vectors for Pichia pastoris are varied,but they can not be used in food vocation,
because of the need of methanol in expression and the leading-in of antibiotic gene by transformation.This research designed to replace the methanol induced AOX promoter by Pichia pastoris 's constitutional promoter,GAP promoter,and successfully constructed the secreting expression vector pGAPH αfor Pichia
pastoris .The gene encoding endo-β-1,4-xylanase from Trichoderma Reesei,and xyn 2gene were used as a reporter gene,and then the function probation indicated that the xyn 2gene could be overexpressed in
Pichia pastoris .Based on this neotype secreting expression vector pGAPH αⅡ,we replaced the α-Factor by inulase gene's signal peptide sequence which had been optimized in codon,the results showed that the showed gene's signal peptide could also utility guide the secreting expression of xyn 2gene.
Key words:Pichia pastoris ;expression vector;GAP promoter;INU signal peptide 随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母
（Methylotrophic yeast ）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源
蛋白表达系统之一，已
有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2]。
然而，虽然用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多，却难于适用食品蛋白的表达及工业生产要求。主要影响因素有两点：pHIL 、pPIC 系列表达载体由于
第40卷第7期东北农业大学学报40(7):55~592009年7月
Journal of Northeast Agricultural University
July 2009
1.2.3毕赤酵母表达载体的构建
质粒DNA提取、电泳、酶切、大肠杆菌感受态制备、转化等操作参见[6]。连接反应方法同前[7]。
1.2.4毕赤酵母的转化
参照Invitrogen公司Pichia Expression Kit提供的说明书，采用电击转化毕赤酵母。
1.2.5木聚糖酶活性的测定
DNS法测定木聚糖酶活性[8]。
2结果与分析
2.1GAP启动子的克隆
以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，用设计合成的pGAP基因特异引物进行PCR扩增。得到500bp的PCR产物，电泳结果如图1。连接pMD18-T载体，酶切鉴定正确后测序。测序结果表明，所得序列与Genbank上的GAP启动子序列完全相同，将该质粒命名为pTGAP。
abp263需要甲醇诱导方能起作用，在高密度发酵培养时安全性差；pGAPZ系列表达载体在外源基因的转化过程中又引入了抗生素基因，生物安全性低，不符合食品蛋白生产要求。同时，现有的毕赤酵母表达载体多采用α-Factor信号肽引导表达蛋白向细胞外分泌，但是其引导高分子质量蛋白分泌的能力并不理想。因此，寻和利用新的分泌信号肽也是构建高效分泌表达载体的关键之一。本研究从启动子和信号肽的替换入手，设计和构建新型毕赤酵母分泌表达载体，为在毕赤酵母中安全高效分泌表达外源蛋白奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株及质粒
毕赤酵母菌株GS115、大肠杆菌菌株E.coli DH5α、质粒PPIC9、pPIC9-xyn2、pTxyn2均由本研究室保存。
1.1.2工具酶及其他试剂
pMD18-T载体、T4DNA连接酶、Pyrobest Taq 酶、限制性内切酶均购自大连宝（TaKaRa）生物工程公司；DNA胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。YPD、MD、MM培养基见Invitrogen公司Pichia Expression Kit提供的说明书。
1.1.3引物
根据三磷酸甘油醛脱氢酶基因序列（Genbank Locus：PPU62648）设计一对GAP启动子扩增引物，由上海生工技术有限公司合成。上游和下游引物分别加有Eco T22Ⅰ和Bam HⅠ酶切位点，其序列如下：pGAP-Sense：5′ATGCATGATCCTTTTTTGTAG AAATG3′
pGAP-Antisense：5′GGATCCTGTGTTTTZGAT AGTTGTTC3′
1.2方法
1.2.1GAP启动子的克隆
毕赤酵母GS115菌株接种于YPD培养基，28℃摇床培养20h，离心收集菌体，提取酵母基因组DNA[3]。以基因组DNA为模板，用pGAP基因特异引物进行PCR扩增。反应体积50μL，引物各加20 pmol，94℃，1min；51℃，45s；72℃，1min扩增30个循环。回收PCR产物并连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌。酶切鉴定正确后的阳性克隆送交测序。
1.2.2菊粉酶基因信号肽INU的密码子优化
参照文献[4]，根据毕赤酵母密码子用法表[5]，优化菊粉酶信号肽序列INU并设计合成接头。经
密码子改造后的接头序列如下：
M1
500bp
M-Marker DL2000;1-GAP启动子的PCR扩增产物
M-Marker DL2000;1-The PCR product of pGAP promoter
图1GAP启动子的PCR扩增
Fig.1PCR pruduct of pGAP promoter
5′GATCCACCATGAAGTT CGCTTACTCC TTG TTG TTGCCATT GGCTGGTG TCTCT
3′GTGGTACTT CAAGCGAATGAGGAACAACA ACGGTAACCGACCACAGAGAGCT TCT GTT ATT AACTACAAGAGATAC3′
CGA AGACAA TAATTGATG TTCTCT ATG5′
·56·东北农业大学学报第40卷
Xho ⅠAat ⅡSac ⅠEco T22Ⅰ
Bam H Ⅰ
Sna B Ⅰ
Eco R ⅠNot Ⅰ
Bst11077Ⅰ
Amp r Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE TT
S 5′AOXI
pPIC98023bp Bam H Ⅰ
Eco T22Ⅰ
Amp r LacZ
pGAP
ori
pPGAP
3190bp
Bam H Ⅰ+Eco T22ⅠBam H Ⅰ+Eco T22Ⅰ
Aat Ⅱ
Xho ⅠSac ⅠEco T22Ⅰ
Bam H Ⅰ
Sna B Ⅰ
Eco R ⅠNot Ⅰ
Bst11077Ⅰ
3′AOX1
HIS4ORE
TT Co1E1
Amp r
5′AOXI
pGAP α-Factor pGAPH α8256bp 图2
毕赤酵母表达载体pGAPH α的构建
Fig.2
Construction of expression vector pGAPH αfor Pichia pastoris
Xho ⅠAat ⅡSac ⅠEco T22Ⅰ
Bam H ⅠSna B ⅠEco R ⅠNot Ⅰ
Bst11077Ⅰ
Amp r
纸浆模Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE
TT
5′AOXI
pGAP α-Factor pGAPH α8256bp
Amp
LacZ
ori
pTxyn23170bp
p
o
Eco R Ⅰxyn 2
Not Ⅰ
Eco R Ⅰ+Not ⅠEco R Ⅰ+Not Ⅰ
Xho ⅠAat Ⅱ
Sac ⅠEco T22ⅠBam H ⅠSna B ⅠEco R Ⅰ
Not Ⅰ
Bst11077Ⅰ
Amp r
Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE
TT 5′AOXI
pGAP α-Factor pGAPH α-xyn2
8826bp
Bgl Ⅱxyn 2
Bgl Ⅱ
图3
毕赤酵母表达载体pGAPH α-xyn2的构建
Fig.3
Construction of expression vector pGAPH α-xyn2for P ichia pastoris
2.2毕赤酵母表达载体pGAPH α的构建
毕赤酵母表达载体pGAPH α的构建过程如图2所示。以Bam H Ⅰ、Eco T22Ⅰ双酶切pTGAP 和
pPIC9载体，分别回收约500bp 的GAP 启动子片段和约8000bp 的pPIC9载体大片段，连接，构建成毕赤酵母表达载体pGAPH α。
宋庆凤等：新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证第7期·57·
xyn2XhoⅠ
AatⅡSacⅠEco T22Ⅰ
Bam HⅠ
Sna BⅠ
Eco RⅠ
NotⅠ
Bst11077Ⅰ
瓦特连杆Amp r
Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE
TT
5′AOXI
pGAP
α-Factor
pGAPHα-xyn2
8826bp
Bam HⅠ
INU
Sna BⅠBamHⅠ+SnaBⅠ载体构建
xyn2
XhoⅠ
AatⅡ
SacⅠ
Bam HⅠ
导电碳油Sna BⅠ
Eco RⅠ
NotⅠBst11077Ⅰ
Amp r
Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE
TT
5′AOXI
pGAP
INU
pGAPHα-xyn2
8653bp
BglⅡ
BglⅡ
图4毕赤酵母表达载体pGAPHI-xyn2的构建
Fig.4Construction of expression vector pGAPHI-xyn2for P ichia pastoris
表13种不同载体表达xyn2基因的酶活性测定
Table1Activities of exoenzyme expressed by the three secreting expression vectors（IU·mL-1）
菌株/质粒Strains/Plasmids 12345
平均值
Average
GS115/pPIC9-xyn2 GS115/pGAPHα-xyn2 GS115/pGAPHI-xyn2131
115
73
131
94
72
139
93
72
130
63
66
133
94
64
132.8
91.8
69.4
2.3毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2的构建
分别以Not I、Xho I双酶切pTxyn2和pGA-PHα，pTxyn2回收570bp xyn2基因片段，与酶切回收后的pGAPHα载体大片段连接，构建成毕赤酵母重组表达质粒pGAPHα-xyn2（见图3）。
2.4毕赤酵母表达载体pGAPHI-xyn2的构建
以Bam H I、Sna B I双酶切质粒pGAPHα-xyn2，与经密码子优化的菊粉酶基因信号肽INU 连接，构建食品级毕赤酵母重组表达质粒pGAPHI-xyn2（见图4）。
2.5新型毕赤酵母表达载体的功能验证
BglⅡ酶切构建好的2种新型毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2和pGAPHI-xyn2，使质粒线性化，电击法转化毕赤酵母GS115，筛选转化子。将转化子在YPD培养基中震荡培养48h，离心取上清液，测定木聚糖酶活性，以毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9-xyn2为对照，试验结果见表1。在没有甲醇诱导的情况下，GS115/pGAPHα-xyn2菌株表达的木聚糖酶活性最高达到115U·mL-1，平均为91.8U·mL-1，表明GAP启动子可以调控外源基因在毕赤酵母中的高水平组成型表达，新型表达载体pGAPHα构建成功。GS115/pGAPHI-xyn2菌株表达的木聚糖酶活性平均为69.4U·mL-1，表明在毕赤酵母中菊粉酶基因信号肽能够有效地引导蛋白质分泌。
·58·东北农业大学学报第40卷
3讨论
启动子在基因表达过程中具有很重要的作用，本文用GAP启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的AOX启动子，构建组成型表达载体pGAPHα。在生产和应用过程中无需甲醇诱导，大大增加了安全性。
同时，与pGAPZ系列组成型表达载体相比，pGAPHα在转化过程中无抗生素基因被引入，也增加了安全性。尽管在本试验中与AOX启动子相比，GAP启动子调控的xyn2基因表达水平稍低，但是在安全性方面的优势使其有望在食品等领域得到广泛应用。
重组蛋白的高效分泌表达对于提高表达量和产品的纯化都是有利的，在毕赤酵母中，信号肽对不同的异源蛋白分泌效率有很大的差异[10]。本文以经过密码子优化的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU 替换毕赤酵母表达载体pGAPHα上的α-Factor信号肽，能够有效地引导木聚糖酶的分泌。尽管在本试验中，INU信号肽引导木聚糖酶分泌的能力不如α-Factor信号肽，但是由于菊粉酶是大分子蛋白质（90 ku），所以INU信号肽能有效弥补α-Factor信号肽不能有效引导高分子质量蛋白质分泌的缺陷。
4结论
本研究成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPHα，并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn2为报告基因进行功能验证，结果表明该载体可实现xyn2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU替换表达载体上原有的α-Factor信号肽，结果表明INU信号肽能够有效引导外源蛋白XYNII 在毕赤酵母中的分泌表达。
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宋庆凤等：新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证
第7期·59·
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