(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010788492.0
(22)申请日 2020.08.07
(71)申请人 浙江华缔药业集团医药开发有限公
司
地址 311121 浙江省杭州市余杭区仓前街
道文一西路1378号1幢F516室
(72)发明人 周昕 郑蔚 翟璐 赵启超
濮云飞
便携式存储
(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人 张柳
(51)Int.Cl.
C12N 15/82(2006.01)
C07K 14/435(2006.01)
(54)发明名称
纱窗角码
(57)摘要
本发明涉及生物技术领域领域，
特别涉及植物瞬时表达载体的构建及应用。本发明采用人工
合成的序列来提高载体的转录量，同时通过选择
性地添加氨基酸序列来提高目标蛋白的翻译水
平和稳定性，最终在整体上达到提高目标蛋白在
植物叶片细胞积累量的作用。
权利要求书1页 说明书9页序列表6页 附图2页CN 111826394 A 2020.10.27
C N 111826394
A
纸扇
1.植物瞬时表达载体，其特征在于，包括5’UTR区域、MCS区域和SEKDEL序列。
2.如权利要求1所述的植物瞬时表达载体，其特征在于，所述5’UTR区域、MCS区域和SEKDEL序列的序列如SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求1或2所述的植物瞬时表达载体，其特征在于，其以植物表达载体pEAQ为基本骨架。
4.如权利要求1至3任一项所述的植物瞬时表达载体，其特征在于，还包括目的基因，所述目的基因的N端增加PacI酶切位点，C端增加XhoI酶切位点。
5.如权利要求2至4任一项所述的植物瞬时表达载体，其特征在于，其构建方法中，采用如SEQ ID No.2所示的上游引物和如SEQ ID No.3所示的下游引物扩增如SEQ ID No.1所示的序列。
6.如权利要求5所述的植物瞬时表达载体，其特征在于，所述扩增的扩增体系包括22μl ddH 2O、25μl KOD OneTM PCR MasterMix、1μl 10μM如SEQ ID No.2所示的上游引物、1μl 10μM如SEQ ID No.3所示的下游引物、1μl 100ng/μl的含有人工合成序列SEQ ID No.1的质粒模板。
7.如权利要求5或6所述的植物瞬时表达载体，其特征在于，所述扩增的程序为：98℃30秒；28个循环：98℃10秒；55℃30秒；68℃10秒；68℃5分钟；4℃10分钟。
8.如权利要求1至7任一项所述的植物瞬时表达载体在表达外源蛋白中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白包括GFP。
10.植物瞬时表达载体表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建如权利要求1所述的植物瞬时表达载体；
步骤2：在步骤1制得的所述植物瞬时表达载体中插入外源蛋白的基因；获得重组质粒；步骤3：取步骤2制得的重组质粒转化入宿主感受态中，培养，收集菌液，浸润植物叶片，提取蛋白。
权 利 要 求 书1/1页CN 111826394 A
植物瞬时表达载体的构建及应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域领域，特别涉及植物瞬时表达载体的构建及应用。
背景技术
[0002]植物表达系统与哺乳动物细胞表达系统、微生物发酵系统一样，是一个具有广阔应用前景的生物蛋白表达反应器。哺乳动物细胞表达系统具有产量高、体系成熟、与人类细胞相近等优势而被普遍推广，但运行价格相对昂贵；微生物发酵系统技术也相当完备，同时产量高、价格低廉，但由于细胞种类的差异，微生物发酵系统并不能很好地表达需要特定蛋白修饰的目的蛋白。植物表达系统具有先天的优势，比如植物的生物量限制少、生长快、成本低与哺乳动物表达系统，同时植物细胞能够对蛋白进行各种翻译后修饰，可以弥补微生物发酵系统及昆虫表达系统的不足，具有良好的生产前景，是商业应用是一个比较热门的研究方向。
[0003]在植物内进行目标蛋白表达，一个有效的植物外源蛋白表达载体是至关重要的。当前阶段，国内植物外源蛋白表达载体主要的应用在处于基础科研领域，对于能够进行高效商业生产的应用载体的探索还很少。国际上植物重组蛋白表达企业Medicago和Icon Genetic都根据基础研究和自身研究进展开发了独有的表达载体。因此，通过基因工程的手段来改造和提升植物外源表达载体的表达效率，使其能够满足商业生产目标蛋白的需要，具有重要的现实意义。
发明内容
[0004]有鉴于此，本发明提供了植物瞬时表达载体的构建及应用。本发明采用人工合成的序列来提高载体的转录量，同时通过选择性地添加氨基酸序列来提高目标蛋白的翻译水平和稳定性，最终在整体上达到提高目标蛋白在植物叶片细胞积累量的作用。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]本发明提供了植物瞬时表达载体，包括5’UTR区域、MCS区域和SEKDEL序列。[0007]在本发明的一些具体实施方案中，所述5’UTR区域、MCS区域和SEKDEL序列的序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]在本发明的一些具体实施方案中，所述的植物瞬时表达载体以植物表达载体pEAQ 为基本骨架。载体构建
[0009]在本发明的一些具体实施方案中，所述的植物瞬时表达载体还包括目的基因，所述目的基因的N端增加PacI酶切位点，C端增加XhoI酶切位点。
[0010]在本发明的一些具体实施方案中，所述的植物瞬时表达载体的构建方法中，采用如SEQ ID No.2所示的上游引物和如SEQ ID No.3所示的下游引物扩增如SEQ ID No.1所示的序列。
[0011]在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增的扩增体系包括22μl ddH2O、25μl KOD OneTM PCRMasterMix、1μl 10μM如SEQ ID No.2所示的上游引物、1μl 10μM如SEQ ID
No.3所示的下游引物、1μl 100ng/μl的含有人工合成序列SEQ ID No.1的质粒模板。[0012]在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增的程序为：98℃30秒；28个循环：98℃10秒；55℃30秒；68℃10秒；68℃5分钟；4℃10分钟。
[0013]本发明还提供了所述的植物瞬时表达载体在表达外源蛋白中的应用。
[0014]在本发明的一些具体实施方案中，所述外源蛋白包括GFP。
[0015]在上述研究的基础上，本发明还提供了植物瞬时表达载体表达外源蛋白的方法，包括如下步骤：
[0016]步骤1：构建所述的植物瞬时表达载体；
[0017]步骤2：在步骤1制得的所述植物瞬时表达载体中插入外源蛋白的基因；获得重组质粒；
[0018]步骤3：取步骤2制得的重组质粒转化入宿主感受态中，培养，收集菌液，浸润植物叶片，提取蛋白。
[0019]现阶段提高植物外源蛋白表达载体表达量主要是从两个方面，一是提高载体表达的目标基因在植物细胞里的转录量，二是通过一些方法提高蛋白的翻译量和积累量。本发明采用人工合成的序列来提高载体的转录量，同时通过选择性地添加氨基酸序列来提高目标蛋白的翻译水平和稳定性，最终在整体上达到提高目标蛋白在植物叶片细胞积累量的作用。
[0020]本发明提供的经过改造之后的pEAQ载体被命名为pEAQE，在表达外源蛋白的能力上与原来的p
EAQ载体相比有显著的提升。该类提升主要是通过增强该载体对目标基因在细胞内的转录水平、同时提升蛋白在细胞内的积累量来实现的。特别是针对一些在植物细胞内表达可能不太稳定的外源蛋白，其SEKDEL的选择性融合表达可以帮助目标蛋白在植物细胞内更加稳定表达和积累。能够为后期进行商业蛋白表达的开发提供优质的表达载体平台基础。同时，该pEAQE植物表达载体巧妙的酶切位点设计，为需要添加融合表达SEKDEL肽段的蛋白操作提供了非常简洁的克隆手法。节约了实验室操作在分子克隆上的人力时间和试剂成本。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0022]图1示插入GFP的质粒图谱；
[0023]图2示紫外荧光比较不同载体GFP荧光差异的照片；
[0024]图3示Q-PCR比较不同载体中GFP mRNA在转录水平的数据差异；
[0025]图4示WB比较不同载体中GFP蛋白表达数据差异。
具体实施方式
[0026]本发明公开了一种植物瞬时表达载体的构建及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方
冷粘鞋法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0027]本发明提供的植物瞬时表达载体的构建及应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0028]下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0029]实施例1pEAQE载体的构建
[0030](1)、以植物表达载体pEAQ为基本骨架，用PacI和XhoI两个酶切位点进行2个小时酶切，然后通过DNA凝胶电泳回收9200bp片段；
[0031](2)、合成含有人工序列如SEQ ID No.1所示，包括5’UTR区域、MCS区域、SEKDEL序列；
[0032](3)、设计扩增人工序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQ ID No.3所示；
[0033](4)、TOYOBO的KOD One TM PCRMasterMix进行扩增反应，扩增体系为：22ul ddH2O、25ulKOD One TM PCRMasterMix、1ul 10uM上游引物、1ul 10uM下游引物、1ul 100ng/ul的含有人工合成序列SEQ ID No.1的质粒模板。PCR扩增程序：98度30秒；28个循环：98度10秒；55度30秒；68度10秒；最后68度5分钟；4度10分钟；
[0034](5)、在最终扩增的基因片段N端增加了PacI酶切位点，C端增加了XhoI酶切位点。经过凝胶电泳进行割胶回收片段；用诺唯赞的Infusion酶进行单片段同源重组链接载体骨架和扩增片段；
[0035](6)、热激转化DH5α感受态后涂Kana抗性培养基，于第二天进行菌落PCR验证，挑选阳性克隆摇菌并提取相应的质粒测序。将测序结果完全正确的质粒保存，序列如SEQ IDNo.6所示。
[0036]SEQ ID No.1：合成的人工序列
[0037]CAGTGAATTGTTAATTAAGAATTCGAGCTCCACCGCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTAT CTGTCACTTTATTGAGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCC ATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAG ACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCA CTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTTTaAAGAGtCGCAcCCAaAA CGCTCaAACcCAATtatTCaACATcTATTtAAgGTCcCTAAAAATGGCCACCCCCGGGAGTGAAAAAGACGAATTA
TAGCTCGAGGCCTTTAACTCTGGT
[0038]SEQ ID No.2：扩增人工序列上游引物
[0039]CAGTGAATTGTTAATTAAGGAAACCTC
[0040]SEQ ID No.3：扩增人工序列下游引物迎宾机器人
[0041]ACCAGAGTTAAAGGCCTCGAGCTAGTG
[0042]实施例2在pEAQE载体上插入GFP基因
[0043](1)、以植物表达载体pEAQE为基本骨架，用SmaI酶切位点进行2个小时酶切，然后通过DNA凝胶电泳回收10469bp片段；
[0044](2)、设计扩增人工序列基因片段的扩增引物，上游引物SEQ ID No.4，下游引物SEQ ID No.5；
[0045](3)、TOYOBO的KOD One TM PCRMasterMix进行扩增反应，扩增体系为：22ul ddH2O、
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