癌基因VGLL1及其编码蛋白的应用

癌基因vgll1及其编码蛋白的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种新的癌基因及其编码蛋白的应用，特别涉及癌基因vgll1及其编码蛋白的应用。

背景技术：

2.目前，卵巢癌的发病率在全球范围内居于女性恶性肿瘤的首位，且卵巢癌的发病正在呈现出年轻化的趋势，成为威胁女性健康的一个重要因素。卵巢癌的方式在不同地区和医院间有所差别，大致包括手术、放疗、系统等方式。70％的卵巢癌患者在初次诊断时候已经发生转移，细胞减灭术联合辅助性化疗已发生了转移，细胞减灭术联合辅助性化疗的方案也很难达到治愈效果，超过70％患者会复发。然而，卵巢癌发生转移的具体机制并不清楚，其中腹膜是最常见的卵巢癌转移部位，有腹膜转移的患者5年生存率不足30％。其中网膜作为腹膜重要组成部分最容易受累，且网膜转移伴腹水形成更加速了肿瘤的进展。可见，明确卵巢癌发生网膜转移的具体机制，并到抑制卵巢癌转移的靶点，对于改善卵巢癌至关重要。
3.高迁移率族蛋白(highmobility group protein，hmg)通常分为三大超家族 hmg1/hmg2家族、hmg14/hmg17家族及hmga1家族。hmga1的蛋白具有结构转录因子的功能，参与多种途径的靶基因启动因子结构激活并和不同的细胞进程都有关，包括诱导基因的表达的调控；hmga1蛋白在相关位点上代替h1组蛋白，从而改变染质的结构；诱导致瘤性转变；促进肿瘤细胞增殖和迁移。近期的研究表明，hmga1参与了许多与肿瘤相关的基因的转录调控，可与核骨架结合序列(mars/sars)结合，这些序列能将染质锚定在细胞核中央位置，还能将在rna转录和翻译过程中都起作用的独立dna区域组织成拓扑结构，进而改变染质的结构，进一步活化染质的转录。hmga1可能通过对上述与肿瘤有关的基因的转录调控而导致肿瘤的恶性进展。
4.tead转录因子又称转录增强因子，是hippo-yap信号传递的关键部分，调节与细胞增殖、分化等相关进程。在哺乳动物中，tead具有高度保守的结构域，其四个组成成员tead1-4都包含一个与dna结合的tea结构域(dbd)，以及一个与转录共激活因子(yap/taz)相互作用的反式激活结构域(ybd)和凋亡相关的多种基因的表达。在tead家族中，尤其是tead1和tead4与多种癌症的发展显著相关，其功能在整个家族中占主导地位。例如有研究证明tead1可以调节在多种肿瘤中过度表达的癌症生物标志物间皮素，tead1与yap的协同作用能诱导细胞生长还能上调致癌基因，导致皮肤黑素瘤和胚胎横纹肌肉瘤的恶化。tead4也是近几年来被多次报道的一个重要的转录因子，在胃癌、结直肠癌等多种癌症中促进癌症细胞增殖和转移。且tead4也被证明可以不依赖于yap/taz而独立发挥转录调控功能。tead亚细胞定位的变化是tead 独立于hippo信号通路调节其转录活性的一种重要机制。有趣的是，无论是依赖还是独立于yap/taz，teads表达和活性的增加都与几种实体肿瘤(如乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌)的进展有关，因此teads也成为肿瘤进展和靶标的重要介质。
5.vgll1(vestigial-like 1)是果蝇转录共激活因子vestigial(vg)，其家族主要由vgll1-4组成，其含有toudu结构域，介导与tea结构域转录因子 (teads)的相互作用。研究发现vgll1在胃癌、乳腺癌、卵巢癌均高表达，有促进肿瘤恶性进展的作用。我们研究结果表明，vgll1可以作为转录共激活因子结合tead4，转录活化hmga1，进而激活wnt/β-catenin信号通路，诱导卵巢癌细胞增殖，侵袭转移等恶性进展。因此，探索其分子机制将为解决卵巢癌侵袭转移等问题提供更多切实的理论依据，构造检测vgll1表达试剂盒和设计靶向vgll1的药物对于卵巢癌的诊治显得尤为重要。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种新的癌基因vgll1(vestigial like familymember 1)及其编码蛋白的应用。
7.本发明研究了vgll1在肿瘤组织特别是卵巢癌中的表达特点及其调控机制、研究vgll1的新功能并提供vgll1的新应用。
8.为实现上述目的，所采取的技术方案：
9.本发明提供了vgll1基因和/或其编码蛋白在制备癌症的药物中的应用。
10.本发明提供了降低vgll1基因表达的试剂和/或减少vgll1蛋白的试剂在制备癌症的药物中的应用。
11.优选地，所述降低vgll1基因表达的试剂包括降低vgll1基因表达的 shrna；更优选地，所述shrna的序列如seq id no：4和/或seq id no：5 所示。
12.优选地，所述癌症包括抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的转移、抑制肿瘤细胞的成瘤性和/或诱导肿瘤细胞凋亡。
13.本发明提供了vgll1基因和/或其编码蛋白在制备用于癌症诊断和/或预后判断的试剂或试剂盒中的应用。
14.本发明提供了检测vgll1的试剂在制备用于癌症诊断和/或预后判断的试剂或试剂盒中的应用。
15.优选地，所述检测vgll1的试剂包括序列如seq id no：1和seq id no： 2的引物对和/或vgll1抗体。
16.优选地，所述癌症为卵巢癌。
17.本发明提供了一种癌症的药物，包括降低vgll1基因表达的shrna，所述shrna的序列如seq id no：4和/或seq id no：5所示。优选地，所述癌症为卵巢癌。
18.本发明提供了一种用于癌症诊断和/或预后判断的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括检测vgll1的引物对和/或vgll1抗体，所述引物对的序列如 seq id no：1和seq id no：2。优选地，所述癌症为卵巢癌。
19.有益效果：
20.本发明在卵巢癌肿瘤细胞中发现了一种新的癌基因vgll1，通过在大量临床样品中检测发现，vgll1在卵巢癌患者中呈现较高的表达水平，且与病人的不良预后以及内分泌耐受现象的产生密切相关。体内、外功能性研究分析表明，vgll1能够有效促进卵巢癌细胞的增殖并促进其凋亡。通过抑制卵巢癌细胞的vgll1表达水平，抑制卵巢癌细胞侵袭转移能力。综合以上，本研究发现vgll1在卵巢癌的恶性发展过程中具有重要作用，vgll1可促
进肿瘤细胞的恶性增殖、转移，本发明为卵巢癌的提供了新的诊疗策略和药物筛选平台。
附图说明
21.图1显示公共数据库tcga、及本中心10例新鲜临床样本(5例卵巢癌原发病灶vs 5例腹膜转移癌组织)中vgll1的表达情况；图中abundance ofprimary:原发灶的表达丰度abundance of metastasis：转移灶的表达丰度。图2显示了7对卵巢癌病人组织和正常卵巢组织、卵巢癌细胞系中vgll1的表达情况。
22.图3显示了vgll1高表达与卵巢癌病人的转移情况及不良预后密切相关，与公共数据库km-plotter分析结果相一致。
23.图4构建稳定的vgll1高表达和低表达的卵巢癌细胞株。
24.图5显示vgll1表达水平的改变影响卵巢癌细胞体外的增殖能力及转移能力。
25.图6显示vgll1表达水平的改变影响卵巢癌细胞的体内成瘤能力和形成远处转移瘤的能力；图中shvgll1#1对应的序列是sh-1，shvgll1#1/vgll1是先沉默vgll1然后过表达vgll1。
26.图7显示在卵巢癌中，在卵巢癌细胞中构建多西环素(doxycycline,dox) 诱导表达系统以诱导性下调vgll1的表达。通过体内动物实验，我们观察到，通过dox诱导vgll1的低表达，可显著抑制肿瘤生长和远处转移。因此，我们认为vgll1可作为改善卵巢癌患者临床预后的潜在靶点。
27.具体实施方法：
28.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
29.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
30.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
31.1.rna-seq高通量测序(结果如图1中a-c)
32.方法：通过提取5例卵巢癌原发灶和5例腹膜转移灶的癌组织的rna进行高通量测序，发现vgll1在腹膜转移灶的癌组织中显著高表达，用western-blot 辅以验证，与测序结果一致。
33.2.ihc检测vgll1在卵巢癌病人的临床标本中的表达(结果如图2中a-e)
34.使用vgll1的特异性抗体在卵巢癌组织(转移灶vs原发灶)、正常卵巢组织切片中进行检测，结果显示vgll1在卵巢癌组织中相对于正常卵巢组织显著上调，更重要的是，vgll1在转移的卵巢癌组织中相对于非转移的卵巢癌组织表达显著上调。
35.3.vgll1高表达具有临床意义(结果如图3中a-d)
36.通过spss进行统计分析发现，vgll1在临床样本中的高表达与卵巢癌病人的生存率低、无复发生存率低密切相关。
37.4.构建稳定的vgll1高表达和低表达的卵巢癌细胞株(结果如图4中a-b)
38.卵巢癌细胞株a2780和ovcar3由dmem培养基(dmem；gibco brl) 额外添加10％的
胎牛血清(gibco brl)在37℃的二氧化碳培养箱进行培养。
39.①
构建vgll1的表达质粒
40.用pcr扩增vgll1的cdna全长序列，引物序列如下：
41.f：ggatgaacacttctccagagctc
42.r：atggagacgagtaacgccactg
43.将纯化的vgll1全长序列构建到plvx-ires-puro表达载体上，获得 vgll1表达质粒plvx-vgll1。
44.(vgll1全长序列：
45.atggaagaaatgaagaagactgccatccggctgcccaaaggcaaacaga agcctataaagacggaatggaattcccggtgtgtccttttcacctacttcc aaggggacatcagcagcgtagtggatgaacacttctccagagctctgag caatatcaagagcccccaggaattgaccccctcgagtcagagtgaaggt gtgatgctgaaaaacgatgatagcatgtctccaaatcagtggcgttactc gtctccatggacaaagccacaaccagaagtacctgtcacaaaccgtgccg ccaactgcaacttgcatgtgcctggtcccatggctgtgaatcagttctcac cgtccctggctaggagggcctctgttcggcctggggagctgtggcatttc tcctccctggcgggcaccagctccttagagcctggctactctcatcccttc cccgctcggcacctggttccagagccccagcctgatgggaaacgtgagcc tctcctaagtctcctccagcaagacagatgcctagcccgtcctcaggaat ctgccgccagggagaatggcaaccctggccagatagctggaagcacagg gttgctcttcaacctgcctcccggctcagttcactataagaaactatatgt atctcgtggatctgccagtaccagccttccaaatgaaactctttcagagtt agagacacctgggaaatactcacttacaccaccaaaccactggggccac ccacatcgatacctgcagcatctttag)。
46.②
转染卵巢癌细胞
47.分别利用lipofectamine2000(invitrogen，#11668)和优化的包装质粒(invitrogen,k4975-00)将获得的plvx-vgll1和作为对照的plvx空载体 (plvx-vector)转入293ft细胞，并于12小时后补充添加10％胎牛血清的 dmem培养基。48小时及72小时后收集慢病毒上清，对a2780和ovcar3 细胞系进行感染。用嘌呤霉素(2ug/ml；thermo fisher,a1113802)筛选2周左右可得到稳定的vgll1过表达的细胞株a2780-vgll1和ovcar3-vgll1，对照细胞株分别为a2780-vec和ovcar3-vec。
48.5、构建稳定沉默vgll1表达的卵巢癌细胞株
49.卵巢癌细胞株a2780和ovcar3由dmem培养基(dmem；gibco brl) 辅以10％的胎牛血清(gibco brl)在37℃的二氧化碳培养箱进行培养。稳定表达特异性干扰序列的vgll1-shrna(sh-1：5'
‑ꢀ
ggtgatggtccagaattaaga-3'；sh-2：5'-gccagtaccagccttccaaat-3) 和阴性对照(psihiv-ct1)由genecopoeia公司提供，利用lipofectamine2000 (invitrogen，11668)和优化的包装质粒(genecopoeia，hpk-lvtr)将 vgll1-shrna1,2和作为对照的psihiv-ct1转入293ft细胞，并于12小时后更换培养基dmem培养基(gibco brl)辅以10％的胎牛血清(gibco brl)。24 小时后连续收集逆转录病毒上清，转导进入a2780和ovcar3细胞系。转染 48小时后用3μg/ml的g418(geneticin)筛选2周左右得到稳定的vgll1沉默的细胞株a2780-sh1、a2780-sh2、ovcar3-sh1、ovcar3-sh2和其相应的对照细胞株a2780-ct1、ovcar3-ct1。
50.6、vgll1基因表达的检测
51.以上建立的所有细胞株均需通过western-blot在蛋白水平上检测vgll1的表达情
况。
52.vgll1抗体：10124-2-ap(proteintech group,inc,usa)
53.7、卵巢癌细胞增殖能力检测(结果如图5)
54.(1)体外实验：细胞生长实验(结果如图5中a)
55.通过mtt实验检测高表达vgll1、沉默vgll1的细胞生长率的变化。实验操作按照细胞增殖mtt试剂盒(roche，mannheim)说明书进行。简述如下：分别将实验组细胞和对照组细胞按1
×
104个/孔接种于24孔培养板中，每隔24 小时往一组细胞中加入100μl浓度为l0.3mg/ml的mtt标记混合物，培养4 小时后用酶标仪(tecan)测量吸光值(od值)，本实验平行重复3次。
56.结果分析：mtt实验结果显示高表达vgll1能促进卵巢癌细胞的生长，而沉默vgll1则抑制细胞生长。
57.(2)体外实验：平板克隆形成实验(结果如图5中b)
58.分别将实验组细胞和对照组细胞接种于6孔板中，每孔1
×
103个。常规培养 10天后，用结晶紫染，计数克隆，此实验平行重复3次，计算平均值和标准差。
59.结果分析：实验结果显示vgll1促进卵巢癌细胞的克隆形成能力。
60.(2)体外实验：edu增殖实验(结果如图5中c-d)
61.分别将实验组细胞和对照组细胞接种于96孔板中，每孔1
×
103个。贴壁后，用edu(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)染，计数edu+细胞数，此实验平行重复3次，计算平均值和标准差。
62.(3)体内实验：皮下成瘤实验(结果如图6中a-c)
63.将1
×
106个实验组细胞和对照组细胞(a2780-vector)分别注射到8只4周龄左右裸鼠的左侧背部。35天后将裸鼠身上长出的肿瘤切除，25天后统计裸鼠的肿瘤体积、肿瘤及其生存率。
64.结果分析：结果显示vgll1高表达与小鼠切除肿瘤后的生存率显著负相关， vgll1高表达明确指示较差的预后。因此，vgll1可作为卵巢癌患者不良预后的潜在指标。
65.8、卵巢癌细胞体内转移能力分析
66.体内实验：裸鼠体内肿瘤转移模型(结果如图6中d-k)
67.(1)通过尾静脉分别向10只裸鼠体内分别注射1
×
106个实验组细胞和对照组细胞。检测注射后3个月后肺内转移肿瘤结节的形成情况和裸鼠的生存情况。动物死亡后，收集各组动物的肺，经过染和h&e染进一步确定肺内形成的肿瘤克隆数。(2)通过腹腔注射分别向10只裸鼠体内分别注射1
×
106个实验组细胞和对照组细胞。检测注射后2个月后裸鼠腹腔内腹膜，肠系膜，大网膜上转移的结节情况及裸鼠的生存情况。结果分析：高表达vgll1抑制卵巢癌细胞在肺器官、腹膜的肿瘤形成能力，表明vgll1具有抑制卵巢癌细胞转移的效果。
68.9.靶向vgll1的作用：
69.在卵巢癌细胞系a2780,ovcar3中，构建多西环素(doxycycline,dox)诱导表达系统以诱导性下调vgll1的表达，通过western blot验证dox 系统构建成功(图7中a)。通过体内动物实验，我们观察到，通过dox诱导 vgll1的低表达，可显著抑制肿瘤生长和远处转移和恶性进展(图7中b-i)。因此，我们认为vgll1可作为改善卵巢癌患者临床预后的潜在
靶点。
70.本发明公开了癌基因vgll1及其编码蛋白的临床应用。发明人对癌基因 vgll1进行体内、外功能性研究，研究结果表明其在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用，vgll1的高表达可诱导卵巢癌的侵袭，转移等恶性进展。为了进一步在卵巢癌中靶向vgll1是否能够抑制卵巢癌细胞的侵袭，转移等恶性进展，我们在卵巢癌细胞中构建多西环素(doxycycline,dox)诱导表达系统以诱导条件性下调vgll1的表达。结果发现诱导条件性下调vgll1可以有效缓解卵巢癌细胞的生长，抑制其侵袭，转移的能力。本发明为解决卵巢癌转移等临床问题提供了新的诊疗思路和药物筛选平台。
71.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：

1.vgll1基因和/或其编码蛋白在制备癌症的药物中的应用。2.降低vgll1基因表达的试剂和/或减少vgll1蛋白的试剂在制备癌症的药物中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述降低vgll1基因表达的试剂包括降低vgll1基因表达的shrna；优选地，所述shrna的序列如seq id no：4和/或seq id no：5所示。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述癌症包括抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的转移、抑制肿瘤细胞的成瘤性和/或诱导肿瘤细胞凋亡。5.vgll1基因和/或其编码蛋白在制备用于癌症诊断和/或预后判断的试剂或试剂盒中的应用。6.检测vgll1的试剂在制备用于癌症诊断和/或预后判断的试剂或试剂盒中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测vgll1的试剂包括序列如seq id no：1和seq id no：2的引物对和/或vgll1抗体。8.根据权利要求1-7任一所述的应用，其特征在于，所述癌症为卵巢癌。9.一种癌症的药物，其特征在于，包括降低vgll1基因表达的shrna，所述shrna的序列如seq id no：4和/或seq id no：5所示。10.一种用于癌症诊断和/或预后判断的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括检测vgll1的引物对和/或vgll1抗体，所述引物对的序列如seq id no：1和seq id no：2。

技术总结

本发明公开了癌基因VGLL1及其编码蛋白的应用，具体来说，公开了VGLL1基因和/或其编码蛋白在制备癌症的药物中的应用，VGLL1基因和/或其编码蛋白在制备用于癌症诊断和/或预后判断的试剂或试剂盒中的应用。本发明发现癌基因VGLL1在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用，VGLL1的高表达可诱导卵巢癌的侵袭，转移等恶性进展。研究结果还发现诱导条件性下调VGLL1可以有效缓解卵巢癌细胞的生长，抑制其侵袭，转移的能力。本发明为解决卵巢癌转移等临床问题提供了新的诊疗思路和药物筛选平台。临床问题提供了新的诊疗思路和药物筛选平台。