(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011148184.8
胞苷酸(22)申请日 2020.10.23
(71)申请人 天津科技大学
地址 300457 天津市滨海新区经济技术开
发区第十三大街9号
(72)发明人 范晓光 胡晨龙 宋雪静 安俊侠
谢希贤 徐庆阳
(74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限
公司 12209
代理人 韩晓梅
(51)Int.Cl.
C12N 9/12(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12P 19/30(2006.01)
alysa_queen
C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称
胞二磷胆碱的方法
(57)摘要
本发明涉及一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，
制备步骤如下：构建工程菌Escherichia coli
CKI ‑CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷 酸胆碱胞苷转移酶；构建工程菌Escherichia
coli PPK ‑UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸
激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶；构建工程
菌Escherichia coli CMK ‑NDK表达来源于大肠
杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶；对发
rta 飞
酵得到的产酶细胞进行破碎，离心收集上清液得
到粗酶液。本发明首次报道了具核梭杆菌来源的
磷酸胆碱胞苷转移酶可以用于胞二磷胆碱的合
成，具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶的异
源可溶性表达量和酶活力更高。权利要求书3页 说明书12页序列表5页 附图2页CN 112481233 A 2021.03.12
C N 112481233
A
1.一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：制备步骤如下：
首先，构建工程菌Escherichia coli CKI‑CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶，胆碱激酶能够催化氯化胆碱形成磷酸胆碱，磷酸胆碱胞苷转移酶能够催化磷酸胆碱和CTP形成胞二磷胆碱；构建工程菌Escherichia coli PPK‑UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶，聚磷酸激酶能够用于催化ATP 再生，胞苷激酶能够用于催化胞苷形成CMP；构建工程菌Escherichia coli CMK‑NDK表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶，胞苷酸激酶能够用于催化CMP形成CDP，二磷酸核苷激酶能够用于催化CDP形成CTP；
其次，对发酵得到的产酶细胞进行破碎，13000rpm离心2min收集上清液得到粗酶液，即得制备胞二磷胆碱用酶制剂。
2.根据权利要求1所述的制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：具体制备步骤如下：
⑴在大肠杆菌E.coli BL21中表达异源的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株Escherichia coli CKI‑CCT；
⑵在大肠杆菌E.coli BL21中表达异源的聚磷酸激酶和胞苷激酶编码基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株Escherichia coli PPK‑UDK；
⑶在大肠杆菌E.coli BL21中表达内源的胞苷酸激酶和二磷酸激酶编码基因，构建出具有胞苷酸激酶和二磷酸激酶活性的菌株Escherichia coli CMK‑NDK；
轮胎标签⑷将上述构建的重组菌株Escherichia coli CKI‑CCT、Escherichia coli PPK‑UDK和Escherichia coli CMK‑NDK分别在培养基中培养，诱导产生高酶活性的胆碱激酶、磷酸胆碱胞苷转移酶、聚磷酸激酶、胞苷激酶、二磷酸激酶和胞苷酸激酶，离心收集产酶细胞；
⑸将步骤⑷中培养获得的产酶细胞Escherichia coli CKI‑CCT、Escherichia coli PPK‑UDK和Escherichia coli CMK‑NDK重悬于平衡缓冲液中并进行细胞破碎，破碎液经13000r/min离心20min后取上清液，即为粗酶液。
3.根据权利要求2所述的制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：所述步骤⑴中是以pET‑Duet质粒为载体在E.coli BL21中过表达胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株E.coli CKI‑CCT；其中，所述胆碱激酶编码基因来源于具核梭杆菌，其扩增引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2；所述磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因来源于具核梭杆菌，其扩增引物为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；所述质粒pET‑Duet的核苷酸序列为SEQ ID NO.13；
所述步骤⑵中是以pET‑Duet质粒为载体在E.coli BL21中过表达聚磷酸激酶和胞苷激酶基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株E.coli PPK‑UDK；其中，所述聚磷酸激酶编码基因来源于类球红细菌，其扩增引物为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6；所述胞苷激酶编码基因来源于嗜热栖热菌，其扩增引物为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8；所述质粒pET‑Duet 的核苷酸序列为SEQ ID NO.13；
所述步骤⑶中是以pET‑Duet质粒为载体在E.coli BL21中过表达胞苷酸激酶和二磷酸激酶基因，构建出具有胞苷酸激酶活性和二磷酸激酶活性的菌株E.coli CMK‑NDK；其中，所述胞苷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌，其扩增引物为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10；所述二磷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌，其扩增引物为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12；所述质粒pET‑Duet的核苷酸序列为SEQ ID NO.13。
8gggg4.根据权利要求2所述的制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：所述步骤⑷中重组菌株在培养基中培养的具体步骤为：
①试管斜面培养：用接种环从甘油保菌管中挑取3‑4环划线接种于带有氨苄青霉素抗性的斜面培养基，于37℃培养箱中培养10‑14h，转接1代；
②茄形瓶斜面培养：用接种环从试管斜面培养基中挑取全部菌体划线接种于带有氨苄青霉素抗性的茄形瓶斜面培养基，于37℃培养箱中培养10‑14h，转接2代；
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③将茄形瓶中的菌全部接种至含有带有氨苄青霉素抗性的发酵培养基中，初始通气量2L/min，溶氧控制在20％～40％，通过自动流加氨水控制pH在7.0，培养温度37℃；
④培养至OD 600＝12‑14时，添加终浓度为0.1‑0.3mM的IPTG诱导表达目的蛋白，调节诱导温度为25‑30℃，诱导培养6‑8h收集菌体；
⑤8000r/min、4℃离心15min收集菌体，再取生理盐水或PBS缓冲液振荡重悬清洗菌体2次，最后离心保存于‑80℃冰箱备用。
5.根据权利要求4所述的制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：所述斜面培养基为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 5g/L，琼脂25g/L，pH 7.0‑
7.2，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，玉米浆30g/L，NaCl 5g/L，KH 2PO 41 g/L，MgSO 40.5 g/L，V H 1mg/L，pH 6.5‑7.2，其中，葡萄糖115℃灭菌15min，其他成分121℃灭菌20min。
6.根据权利要求2至5任一项所述的制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：所述步骤⑸中三种大肠杆菌Escherichia coli CKI ‑CCT、Escherichia coli PPK ‑UDK和Escherichia coli CMK ‑NDK的细胞湿
重用量与平衡缓冲液的比例g：mL依次为12：50、10：50和8：50；
或者，所述平衡缓冲液为50mM Na 2HPO 4和/或300mM NaCl，用NaOH调pH至8.0；
或者，所述细胞破碎的方法为超声破碎、冻融破碎、液氮研磨破碎或者高压匀浆破碎，高压匀浆破碎的破碎条件为：4℃，800‑1000bar。
7.如权利要求1至6任一项所述的酶制剂在胞二磷胆碱的制备方面中的应用。
8.利用如权利要求1至6任一项所述的酶制剂催化制备胞二磷胆碱的方法，其特征在于：所述方法以酶制剂为催化剂，以氯化胆碱、胞苷、六偏磷酸钠和ATP为底物，将酶制剂与氯化胆碱、氯化镁、六偏磷酸钠、ATP、胞苷和Tris ‑HCL缓冲液混合，进行酶催化反应，温度控制在30℃，搅拌转速控制在300r/min，反应过程中能够通过流加NaOH或HCL维持pH值在8.0，合成胞二磷胆碱。
9.根据权利要求8所述的酶制剂催化制备胞二磷胆碱的方法，其特征在于：反应体系中氯化胆碱的浓度为30mM，氯化镁的浓度为60mM，六偏磷酸钠的浓度为60mM，胞苷的浓度为30mM，ATP的浓度为5mM，Tris ‑HCL缓冲液的pH＝8.0、浓度为100mM。
10.根据权利要求8或9所述的酶制剂催化制备胞二磷胆碱的方法，其特征在于：所得反应液中胞二磷胆碱的检测方法为：取反应液经沸水浴灭活后，13000r/min离心2min，取上清液用去离子水稀释至1g/L，
用0.22μm的无菌膜过滤至液相瓶待分析；使用高效液相谱测定胞二磷胆碱的含量，进样量为20μL，谱柱为Sepax HP ‑SAX(4.6×250mm)谱柱，流动相为50mM KH 2PO 4，H 3PO 4调pH3.5，柱温30℃，流速1mL/min，检测波长254nm，胞二磷胆碱保留时
间为6.5min。
制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法
技术领域
[0001]本发明属于化合物生物技术领域，尤其是一种制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法。
背景技术
[0002]胞二磷胆碱是生物体中卵磷脂合成的重要前体。胞二磷胆碱由日本武田药品工业公司首先开发成功，商品名称为“Nicholin ””(尼可林)，现已被中国药典收录作为细胞代谢改善药。胞二磷胆碱是临床用量最大的神经激活剂，能促进卵磷脂的生物合成，恢复神经组织功能，改善脑代谢和循环，可用于急性颅脑外伤和脑手术所引起的意识障碍恢复，并可用于帕金森综合征和老年性痴呆症的辅助。胞二磷胆碱是卵磷脂生物合成的前体，当大脑功能下降时，脑组织内的卵磷脂含量显著减少。补充外
源性胞二磷胆碱即能激活卵磷脂的生物合成，刺激脑干网状结构的兴奋，提高苏醒阈值，恢复神经组织机能，改善脑代谢和神经传导，提高患者的意识水平。
[0003]现有胞二磷胆碱的制备方法主要为化学合成法。通用的方法是采用cytidine ‑5’‑phospho ‑morpholide和磷酸胆碱盐酸盐在乙腈或吡啶中缩合形成胞二磷胆碱。其中，cytidine ‑5’‑phospho ‑morpholide可以通过CMP和吗啉在DCC中脱水缩合(Chemical and Pharmaceutical Bulletin ,1971,19(5):1011–1016.)或者通过选择性磷酸化胞苷(Journal of Chemical Research ,2016,40(6):358–360.)的方法获得。然而，上述合成路线中使用的原料和缩合剂价格昂贵，而且需要在有毒的有机溶剂中完成反应，导致胞二磷胆碱的合成收率较低，生产成本居高不下。
[0004]近年国内大部分的生产多报道为生物转化，以各种微生物为生物催化剂，利用其中的磷酸胆碱胞苷转移酶(Cholinephosphate cytidylyltransferase ，CCT ，EC
2.7.7.15)，以胞苷三磷酸(Cytidine triphosphate，CTP)和磷酸胆碱为底物可直接合成胞二磷胆碱，具有反应条件温和、成本低和工艺简便等特点，但也存在转化率低、产品纯度低和生产规模小等问题。詹谷宇等(中国医药工业杂志,1987,18(6):252–255.)以异常汉逊酵母的静息细胞为生物催化剂，用胞苷酸(Cytidine monophosphate，CMP)和磷酸胆碱生物合成胞二磷胆碱；专利申请号201210066604.7报道了用简单原料碳、氮源，在含有多微生物培养液中生物合成CMP，并累积生成胞二磷胆碱。随分
子生物学技术的发展，基因工程技术成为改良产胞二磷胆碱菌株的新手段。专利201310167034.5报道利用大肠杆菌工程菌异源表达C C T 酶并固定化，以磷酸胆碱和C T P 为原料生物合成胞二磷胆碱；专利申请号201510702581.8报道用经改造的基因工程大肠杆菌菌株作为生物催化剂，用乳清酸和磷酸胆碱生物合成胞二磷胆碱。邓童心等(药物生物技术,2018,25(04):294–298.)通过在酵母中过表达反应关键酶CCT酶而提高胞二磷胆碱的转化率和产量，以CMP和磷酸胆碱为原料，生物转化制造胞二磷胆碱，反应7h摩尔转化率可高达7
3.1％。
[0005]在生物法制备胞二磷胆碱方面，国外主要采用多酶催化体系，通过不同的反应途径获得目标产物。例如，在普遍使用的CMP ‑葡萄糖‑酿酒酵母(CGS)途径中，以CMP、葡萄糖和
说 明 书1/12页CN 112481233 A
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