第42卷第1期2021年1月
Vol42No1
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质谱学报
JournalofChinese MassSpectrometrySociety
高效液相谱-串联质谱法
陈晶燕，陈万勤，王峰，陈，周霞，刘柱，梁晶晶
（浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州310052）
胞苷酸
摘要：建立了高效液相谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定婴幼儿奶粉中胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌吟核苷酸（AMP）、鸟嘌吟核苷酸（GMP）、尿嘧啶核苷核（UMP）、次黄嘌吟核苷酸（IMP）等5种核苷酸含量。使用碱性磷酸酶去磷酸化作用，把样品中的核苷酸水解成相应核苷，经选择性硼酸固相
萃取净化，ACQUITY UPLC HSS T3（2.1mmX100mmXi.8"m）谱柱分离，以5mmol/L甲酸铵溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱。采用电喷雾正离子源，内标法定量，以多反应监测（MRM）模式进行质谱分析°结果表明，奶粉中5种核苷在各自线性范围内的线性关系良好，相关系数均大于0.998，回收率为
74.2%〜110.7%，相对标准偏差在0.8%〜5.3%之间（n=6）,CMP、AMP、GMP、UMP、IMP的定量限
分别为0.7、0.1、0.7、3.3、0.6mg/100g°该方法灵敏度高、重现性好、定量准确，可用于测定婴幼儿奶粉中核苷酸含量°
关键词：高效液相谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）；奶粉；核苷酸；核苷；多反应监测（MRM）
中图分类号:O657.63文献标志码:A文章编号：10042997（2021）01009308
doi：10.7538/zpxb.2019.0156开放科学（资源服务）标识码（OSID）:
Determination of Nucleotides in Infant Milk Powder by High
Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
CHENJing-yan,CHEN Wan-qin,WANG Feng,CHEN Bi-lian,
ZHOU Xia,LIU Zhu,LIANGJing-jing
(.Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou310052,China)
Abstract:Nucleotides are biologically important small molecules composed of a nitroge-nousbase,afive-carbon sugar(ribose or deoxyribose)and at least one phosphate group.Theyplayimportantroleinimprovinggastrointestinaltractrepairafterdamage, maintainingtheimmunesystem andregulatinglipoprotein metabolism.Nowadaysthe roleofdietarynucleotideshasbeenpaidincreaseda t entionininfantnutrition.Dietary nucleotidesarecrucialtomaintainingnormalgrowthanddevelopmentininfants.There-forethecontentsofnucleotidesininfantmilkpowderbecomeimportant.A methodfor
收稿日期：2019-11-15；修回日期：2020-03-10
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基金项目：浙江省市场监管局项目（018007）浙江省食品药品监督管理局科技计划项目（019002）资助
作者简介：陈晶燕（1993—），女（汉族），浙江杭州人，助理研究员，从事分析化学研究。E-mail：506135953@qq
通信作者：陈万勤（1983—），男（汉族），浙江温州人，高级工程师，从事分析化学研究。E-mail：*******************
94质谱学报第42卷
the determination of five nucleotides(cytidine5^-monophosphate(CMP),guanosine5*-monophosphate(GMP),uridine5^-monophosphate(UMP),adenosine5*-monophos-phate(AMP)and inosine5^-monophosphate(IMP))in infant milk powder by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)was deve&oped.Thenuc&eotidesinsamp&e werehydro&yzedbya&kainephosphatasetothe corresponding nuc&eosides.The nuc&eosides were adsorbed by se&ective boric acid so id phase extraction.After purification and e&ution"the chromatographic separation was performed on an ACQUITY UPLC HSS T3column(2.1mmX100mmX1.8g m),and gradiente&uted by5mmo&/L ammonium formate and aceton
itrie"and ana&yzed by HPLC-MS/MSin mu&tip&ereaction monitoring(MRM)modeviapositivee&ectrospray ionization.The contents of nucleotides were quantitatively analyzed by internal standard method.Theresultsshowedthatthelnearrangesoffvenucleot2des2n2nfantformula aregood"thecorrelat2oncoe f2c2entsareabove0.998.F2vek2ndsofnucleos2descanbe separatedw2th2n8m2n.Cyt2d2ne"2nos2neandguanos2nearea l lnear2ntheconcentra-tion range of5-200"g/L,adenosine and uridine are linear in the concentration range of 1-40"g/L and25-1000"g/L,respectively.The recoveries are between74.2%and 110.7%with the relative standard deviations from0.8%to5.3%(/=6).The limits of quantitation of CMP,AMP,GMP,UMP and IMP are0.7,0.1,0.7, 3.3,0.6mg/100g, ur.cyofthe milk powder were .n.lyzed.Themethodissensitive"."h.sgoodreproducibility.ndissuit.formul.products.
Key words:high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)；milk powder；nucleotides；nucleosides；multiple reaction monitoring (MRM)
核苷酸是由含氮碱基、核糖或脱氧核糖和磷酸3种分子连接形成的化合物，主要有胞嘧啶核苷酸（CMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）以及次黄嘌呤
核苷酸（IMP）等5种。核苷酸是生物体内关键的含氮化合物之一，是各种核酸的基本组成单位’核苷酸对于婴幼儿的正常和良好发育发挥着关键作用，外源性核苷酸在摄入后能够被生物体消化吸收、代谢、转运’在婴幼儿奶粉中添加核苷酸对婴儿的生长发育有促进作用，可以提供免疫刺激、促进修复肠道损伤、促进肠道有益菌生长等+13。婴幼儿奶粉中的核苷酸含量是衡量奶粉营养的重要参数之一。很多国家制定了婴幼儿奶粉中核苷酸含量的相关标准，我国规定婴幼儿配方食品中允许添加的核苷酸使用总量为0.12〜0.58g/kg4。
目前，在核苷酸含量的检测过程中，样品前处理方法包括固相萃取法5、酶解法⑷和沉淀杂质法7，定量检测方法主要包括高效液相谱法时0,、毛细管电泳法+1112以及高效液相谱-质谱联用法［1315］等。奶粉中核苷酸含量的检测受到许多因素的干扰，如高含量的蛋白质和脂肪杂质。核苷酸含有磷酸基团，其酸性强、极性大，普通反相液相谱柱难以实现对核苷酸良好的保留和分离。2016年，我国颁布了核苷酸的检验新标准+16，但是该标准在处理奶粉等复杂样品时前处理简单，未进行进一步净化处理，由于核苷酸中CMP极性较强，出峰时间过早，基质干扰严重，不利于样品的准确定量。此外，流动相含有离子对试剂，导致平衡时间过长，谱柱寿命大幅缩短。
本研究拟采用碱性磷酸酶脱去核苷酸上的磷酸基团，水解成相应的核苷，降低被测样品目标物的极性。通过选择性硼酸固相萃取净化, HPLC-MS/MS分析，根据核苷酸和核苷之间的
第1期陈晶燕等：高效液相谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中核苷酸95
转化系数计算婴幼儿奶粉中5种核苷酸含量。
啉
1实验部分
1.1仪器与试剂
Triple Quad5500液相谱-质谱联用仪：美国AB SCIEX公司产品；恒温振荡器、涡旋混合器：德国IKA公司产品；高速离心机：美国Thermo公司产品；氮气吹干仪：天津市恒奥科技有限公司产品。
甲醇、乙腈：谱级，德国Merck公司产品；甲酸、乙酸铵、氨水：谱级，美国Sigma公司产品；Affi-gel601：美国Bio-Rad Laboratories公司产品；碱性磷酸酯酶（来自牛肠黏膜）：美国Sigma公司产品；实验用水：由Milii-Q型超纯水仪制备。
胞嘧啶核苷酸（CMP）（纯度"99%）、鸟嘌吟核苷酸（GMP）（纯度"99%）、尿嘧啶核苷酸（UMP）（纯度"98%）、次黄嘌吟核苷酸（IMP）（纯度"98%）、腺嘌吟核苷酸（AMP）（纯度" 97%）、尿嘧啶核苷（U）（纯度"99%）、胞嘧啶核苷（C）（纯度"99.0%）、腺嘌吟核苷（A）（纯度"99%）、次黄嘌吟核苷（I）（纯度"99%）、鸟嘌吟核苷（G）（纯度"98%）标准品：均为美国Sigma Aldrish公司产品；1-i3C胞嘧啶核苷（纯度100%）、1',2',3',4',5-3C鸟嘌吟核苷（纯度100%）、i,2',3',4',5-i3C次黄嘌吟核苷（纯度100%）内标物质：均为美国Omicron Biochemicals公司产品。
1.2标准溶液的配制
1.2.1储备标准溶液核苷储备标准溶液：准确称取10mg各核苷，用0.1mol/L NaOH溶液溶解，定容至10mL容量瓶中，配制成约1.0 g/L标准储备液，于2〜8e储存。
核苷酸储备标准溶液：准确称取10mg各核苷酸，用水溶解，定容至10mL容量瓶中，得到io g/L标准储备液，于2〜8e储存。
1.2.2混合标准中间液核苷混合标准中间液：分别准确量取适量的核苷储备标准溶液于5mL容量瓶，用水定容，配制成鸟苷、胞苷、次黄嘌吟核苷为40mg/L，腺苷为8mg/L，尿苷为200mg/L的核苷混合标准中间液。
核苷酸混合标准中间液：分别准确量取适量的核苷酸储备标准溶液于5mL容量瓶，用水定容，配制成鸟苷酸、胞苷酸、次黄嘌吟核苷酸为40mg/L，腺苷酸为8mg/L，尿苷酸为200mg/L的核苷酸混合标准中间液。
1.2.3内标储备液分别准确称取大约10mg的i-3C胞嘧啶核苷、i,2',3',4',5-3C 次黄嘌吟核苷和i,2',3',4',5-3C鸟嘌吟核苷，用70%甲醇水溶液溶解并定容至10mL容量瓶中，得到#0g/L的各内标储备液，于2〜8e储存。
1.2.4内标混合工作液移取0.1mL各内标储备液于10mL容量瓶，用水定容，得到10mg/L的内标混合工作液，于2〜8e储存。
1.2.5混合工作标准液取适量的核苷混合标准中间液于5个10mL容量瓶中，分别加入0.1mL内标混合工作液，纯水定容并充分混合后，转移到自动进样瓶内，进行HPLC-MS/MS 分析。
1.3样品前处理
1.3.1碱性磷酸酶溶液配制取20"L碱性磷酸酯酶试剂，用5mL0.5mol/L醋酸铵（pH8.75）将上述酶试剂完全溶解后，保存在4e冰箱中，待用。所配制的酶试剂含量约为12U/50"L。
1.3.2硼酸亲和凝胶制备准确量取50mL 0.1mol/L磷酸钾（pH 6.5）于150mL烧杯中，加入5g Affi-gel601亲和凝胶，盖上金属铝箔，持续搅拌4h。用50mL0.25mol/L磷酸钾（pH10.5）清洗凝胶2次，再向凝胶中加入100mL0.25mol/L磷酸钾（pH10.5），强力涡旋离心管分散凝胶。将0.7mL亲和胶浆体等份转移到带有扣盖的2mL离心管中，待用。1.3.3样品制备将核苷酸在碱性磷酸酶作用下水解成腺嘌吟核苷，示于图1准确称取10g奶粉，用温水充分溶解并定容于100mL 容量瓶中，准确移取1mL至10mL离心管。向离心管中加入1mL0.5mol/L醋酸铵溶液（pH875）、50"L30%浓氨水、50"L1mol/L 氯化镁溶液、50"L10mmol/L硫酸锌溶液和50"L碱性磷酸酶溶液，混匀后，在（37+2）e 恒温摇床中以165r/min振荡2h，取出离心管，分别多次加入1
2.5mL0.5mol/L磷酸钾溶液，将离心管中溶液转移至20mL容量瓶中，用水定容，摇动混匀，待硼酸凝胶净化。
96
质谱学报 第42卷
图1在碱性磷酸酶作用下，腺嘌吟核苷酸水解成腺嘌吟核苷
Fig. 1 Hydrolysis of adenosine nucleotide to adenosine nucleoside at alkaline phosphatase
1. 3・4样品净化 取预先分装好0. 7 mL A ffi-
gel 601的2 mL 离心管，以2 000 r /min 离心
3 min，去除上清液。分别加入1 mL 0. 25 mol/L 磷酸冲洗凝胶和磷酸钾缓冲液(pH 10.5)，涡旋
离心，去除上清液。再次加入1 mL 0.25 mol/L 磷酸钾缓冲液(pH 10.5)，涡旋放置10〜15 min ,
使凝胶完全转化为碱性形式，离心，去掉上清液-向凝胶中加入1 mL 样品溶液和0. 1 mL
10 mg/L 内标混合工作液，振荡10〜15 min ,
以2 000 r /min 离心3 min ，去掉上清液；用
1 mL 0. 25 mol/L 磷酸钾缓冲液(pH 10. 5)冲 洗 凝 胶 "以 2)))r / min 离 心 3 min "去 掉 上 清
液；再用1 mL 水冲洗凝胶，以2 000 r/min 离 心3 min，去掉上清液。加入250 "L 5%甲酸
水溶液，涡旋30 s 分散凝胶并释放出核苷，再
加入1. 75 mL 甲醇，转移至15 mL 离心管。40 °C 氮气吹至液面低于1 mL，用纯水定容至5 mL ,
0.22 g m 水相微孔滤膜过滤后，转移至样品瓶
中，待LC-MS/MS 分析。
<4 实验条件
1. 4. 1 谱条件 谱柱：ACQUITY UPLC
HSS T3 柱(2. 1 mm X 100 mm X 1. 8 g m )；流
动相:A 为5 mmol/L 甲酸铵(pH 6.0),B 为乙
腈；梯度洗脱程序：0〜3.0 min(1%B),3.0〜
4. 5 min(1 % 〜10%B),4. 5 〜
5. 0 min (10 % 〜 40%B ) ,5. 0〜8. 0 min(40%B ) ,8. 0〜8. 5 min
(40% 〜1%B),8.5 〜14.0 min(1%B)；流速: 0. 3 mL/min ；柱温：35 C ；进样量：2 "L 。
1・4. 2质谱条件 电喷雾离子源(ESI )，正离 子扫描模式；电喷雾电压5 500 V ；离子源温度
500 C 。5种核苷和3种内标物的监测离子对
及相关参数列于表1'
表1 8种化合物的质谱参数
Table 1 Mass spectrometric parameters of 8 compounds
化合物
Compound
母离子
Parent ion (m/z)子离子
Product ion (m %z )碰撞电压Colision
energy /eV
去簇电压 Declustering potential/V
保留时间 Retention
time %min 1-13C 胞嘧啶核苷245. 1##2.0 $20
35 1. 76
微型压力传感器芯片
95.#
563512345-3C 鸟嘌吟核苷289. 2152. 0$#930 5.44
135. 0
493012345-3C 次黄嘌吟核苷
274.#
137. 1$#5
30 4.86
##0.05530次黄嘌吟核苷
269.0
137. 0$#640 4.86##9.05440胞嘧啶核苷
244.0
##2.0 $
#8
40 1. 76
95.05540尿嘧啶核苷
245.0##3.0 $#940 2.45
96. 046
40腺嘌吟核苷
268.0
#36.0 $2440 6.94
##9.0
6340
鸟嘌吟核苷
284.0152. 0$22
32 5.44
135. 0
52
32
宣传帽注：$
为定量离子
第1期陈晶燕等：高效液相谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中核苷酸97
2结果与讨论
2.1前处理方法的优化
婴幼儿奶粉组分复杂，包含蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等，样品提取后需净化才能进行HPLC-MS/MS分析。奶粉中核苷酸在碱性磷酸酶催化下水解成相应的核苷，再通过选择性硼酸固相萃取将核苷预分离。此时，在碱性条件下，干扰化合物会从凝胶上去除。
实验对比了Waters Oasis MCX(150mg, 6mL)Waters Oasis HLB(200mg,6mL)、Affi-gel601凝胶)3种固相萃取柱的净化效果。结果发现，利用MCX柱处理核苷标准品溶液时，未能完全保留5种核苷，其中尿苷在谱中未出峰；HLB柱对胞苷、尿苷未能保留，在谱中未出峰；而Affi-gel601凝胶对5种核苷化合物保留较好。因此，选择Affi-gel 601凝胶用于核苷净化。将样品溶液加入制作好的预备凝胶，在样品吸附于凝胶后，用磷酸钾溶液冲洗凝胶除去杂质，再用超纯水清洗凝胶，去除非挥发性的磷酸盐，降低其对质谱仪和谱柱的损耗。通过这种方式，样品中的核苷完全保留于凝胶中，可以进行下一步洗脱步骤。
实验分别比较了5%、10%、20%甲酸水溶液对核苷洗脱效果的影响。结果发现，甲酸浓度对核苷洗脱的效果影响不大，其回收率均在91.67%〜103.03%之间。考虑到甲酸浓度会对质谱仪和谱柱产生影响，因此选用最低浓度的5%甲酸水溶液进行洗脱。2.2谱条件的优化
在相同的流动相下，分别考察了CORTECS C18(2.1mmX1))mmX2.7"m)和ACQUITY
UPLC HSS T3(2.1mmX1))mmX1.8"m)谱柱对5种核苷的分离效能。发现5种核苷在ACQUITY UPLC HSS T3谱柱上均有较强的保留，各化合物均能得到较好的分离，且峰形良好。本实验选择5mmol/L甲酸铵(A 相)和乙腈(B相)作为流动相进行梯度洗脱，并优化洗脱程序，5种核苷标准品的提取离子流谱图示于图2。
2.3质谱条件的优化
根据核苷结构，采用电离源正离子模式，使用AB5500液相谱-质谱联用仪的MSONLY 模式对i0mg/L的5种核苷和3种内标物的单标溶液进行质谱条件优化，得到各化合物的母离子、主要碎片离子、最佳碰撞电压(collision energy,CE)和去簇电压(declustering potential,DP)，列于表1。
注:U.尿嘧啶核苷；G.鸟嘌吟核苷；
C.胞嘧啶核苷；A.腺嘌吟核苷；I.次黄嘌吟核苷
图25种核苷标准品的提取离子流谱图
Fig.2Extractedionchromatogram
of5nucleosidestandards
2.4方法学考察
2.4.1线性范围本实验米用内标法定量，将核苷标准溶液用水稀释为不同浓度的标准系列工作液，向每个样品瓶中加入等量的100"g/L 3种同位素内标溶液，用超纯水定容，配制成鸟苷、肌苷、胞苷为5、10、20、50、100、200"g/L，腺苷为1、2、4、10、20、40"g/L，尿苷为25、50、100、250、500、1000"g/L的核苷系列标准工作液。在优化的仪器条件下检测，用定量离子的峰面积5)对质量浓度(工)进行线性回归，计算5种核苷的线性方程和相关系数，结果列于表2。可见，5种核苷在各自线性范围内的线性关系良好，相关系数均大于0.998。
2.4.2检出限、定量限、回收率和精密度采用基质液添加各化合物标准溶液，以3倍信噪比(S/N)为检出限，10倍信噪比为定量限，结合化合物在奶粉中允许添加的含量，确定CMP、AMP、GMP、UMP、IMP的检出限分别为0.21.0.0
3.0.21.0.99.0.18m g/100g，定量限分别为0.7、0.1、0.7、3.3、0.6mg/100g。核苷-核苷酸转化系数列于表3
。
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