一种大肠杆菌利用甲醇和D-木糖发酵生产D-阿洛酮糖的方法与流程

一种大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法
技术领域
1.本发明属于代谢工程领域，具体一种大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法。

背景技术：

2.d-阿洛酮糖（d-allulose）为d-果糖的c-3的差向异构体，是一种稀有的零能量糖，且甜味是蔗糖的70%。大量的研究证明d-阿洛酮糖还有独特的理化性质和生理功能，如降血脂、降血糖、抗炎、神经保护、清除活性氧(ros)活性和动脉粥样硬化等的作用，因此d-阿洛酮糖作为一种理想的甜味剂和蔗糖代替品，有很好的市场潜力尤其是在保健品和食品行业。
3.d-阿洛酮糖是一种天然存在的稀有单糖，在自然界中存在量极少。其制备方法包括化学合成法，生物合成法。化学合成法包括选择性醇醛缩合合成法、催化加氢法、加成反应法、ferrier重排法等。由于化学合成法存在经济性差、环境污染严重、立体选择性不足等问题，不能够成为制备d-阿洛酮糖的主流方法。与化学法相比，生物酶催化法具有反应条件温和、活性高、使用剂量低，无毒，环境友好等优点。但酶催化依然存在生产成本高，工期长以及热稳定性差等问题。相比之下，微生物发酵法不仅有利于降低工业化生产成本，而且符合当下绿环保的生产原则，为合成d-阿洛酮糖指明了方向。通过基因工程技术改造大肠杆菌，使大肠杆菌能高效利用甲醇和d-木糖合成d-阿洛酮糖并大幅度提升d-阿洛酮糖的产量。

技术实现要素：

4.本发明旨在针对上述问题，提供一种大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法。通过表达外源基因mdh，hps，phi，alse，a6pp，得到能以甲醇和d-木糖为碳源制备d-阿洛酮糖的重组大肠杆菌，再敲除副产物途径基因frmabr， rpia， pfka，pfkb最终得到一株利用甲醇和d-木糖生产d-阿洛酮糖的重组菌株，从而实现碳源的高效利用，提高d-阿洛酮糖的产量。
5.为实现上述目的，本发明的技术方案是：在代谢工程菌株大肠杆菌jm109 (de3)中利用甲醇和d-木糖生产d-阿洛酮糖。首先在e.coli jm109 (de3)中表达需要的甲醇脱氢酶基因mdh，3-己糖-6-磷酸合成酶基因hps，6-磷酸-3-己糖异构酶基因phi，d-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶基因alse，d-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶基因a6pp。为提高alse蛋白的表达量引入蛋白标签sumo。然后，敲除副产物途径基因frmabr，磷酸戊糖途径的关键基因rpia，以及糖酵解途径的关键基因pfka，pfkb，实现碳源的理性控制从而高效生产d-阿洛酮糖。
6.进一步，上述一种大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法，具体包括以下步骤：（1）在e. coli jm109 (de3)中表达路径所需的甲醇脱氢酶基因mdh，3-己糖-6-磷
hps, phi, sumo-alse, a6pp, δfrmabr, δrpia, δpfka, δpfkb)，该菌株能有效利用廉价的甲醇和d-木糖生产d-阿洛酮糖，大大提升了d-阿洛酮糖的产量，最终d-阿洛酮糖产量达到23.92 mm。
附图说明
12.图1细胞工厂图。
13.图2 alse蛋白表达优化效果，（a）sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法验证融合蛋白alse-sumo增加了蛋白的表达量第一泳道为空质粒，第二泳道为蛋白alse，第三泳道为蛋白alse-a6pp，第四泳道为蛋白alse-sumo-a6pp；（b）胞外酶催化验证蛋白alse与融合蛋白alse-sumo的脱磷酸效果；（c）胞外酶催化反应验证融合蛋白alse-sumo对d-阿洛酮糖产量的影响；（d）产物d-阿洛酮糖质谱图。
14.图3敲除基因frmabr的对甲醇消耗和产物生成的影响；（a）重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, sumo-alse, a6pp)产物发酵图；（b）重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, sumo-alse, a6pp, δfrmabr)产物发酵图；（c）重组菌株e. coli (mdh, δfrmabr)和重组菌株e. coli (mdh)验证甲醇消耗发酵图。
15.图4 菌株发酵图；（a）重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, sumo-alse, a6pp, δfrmabr, δrpia)产物发酵图；（b）重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, sumo-alse, a6pp, δfrmabr, δrpia, δpfka)产物发酵图；（c）重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, sumo-alse, a6pp, δfrmabr, δrpia, δpfka, δpfkb)产物发酵图。
具体实施方式
16.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。实施例1将重组菌株e. coli (alse, a6pp)，与重组菌株e. coli (sumo-alse, a6pp)，在37℃含60 μg/ml卡纳抗性30 μg/ml氯霉素抗性的lb培养基中培养，直至od600达到0.8-1.0，添加0.2 mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）蛋白在37℃下过表达16 h，4℃离心法收集细胞，用50 mm ph 7.0的hepes缓冲液其中添加0.1 m氯化钠，洗涤细胞两次。再用相同的缓冲液中重新悬浮细胞，使最终细胞浓度od600达到50。取适量细胞悬浮液在冰水浴中进行超声细胞破碎。离心取上清液用于酶活性实验，其余离心上清液放-20℃保存。
17.配置钼酸盐试剂，溶剂为超纯水，溶质为15 mm钼酸铵和100 mm无水醋酸锌，用浓盐酸调至ph 5.0。配制10%的抗坏血酸试剂用40% naoh调至ph 5.0。
18.酶活反应总体系为600 μl，其中含100 mm ph 7.0的hepes缓冲液，5 mm mgcl2，以10 mm果糖-6-磷酸为底物，添加适量粗酶液，酶活反应在37℃的恒温水浴中进行，反应从加入粗酶液开始，反应时间为25 min，反应结束后立即将离心管放入冰水浴中停止反应，取200 μl样品加入2 ml钼酸试剂，500 μl抗坏血酸试剂，混合均匀后在30℃下使体系充分反应15 min，反应结束后使用紫外分光光度计在波长850 nm下测试吸收峰，实验结果显示融合蛋白sumo-alse的脱磷酸效果是蛋白alse的2-3倍。将酶活反应结束的剩余样品用0.2 μm的滤膜过膜处理，用hplc进行样品分析，d-阿洛酮糖的测定使用谱柱waters sugar-paktmⅰ（rid），流动相为水，流速0.5 ml/min，样品保留时间20 min。测定结果显示添加标签蛋白sumo后d-阿洛酮糖的产量是未添加标签蛋白的4倍。
19.实施例2验证敲除基因frmabr对甲醇消耗以及产物的影响甲醇消耗验证，在敲除了基因frmabr的大肠杆菌jm109 (de3)和野生大肠杆菌jm109 (de3)中表达外源基因mdh，得到菌株e. coli (mdh, δfrmabr)和菌株e. coli (mdh)，在体系为50 ml的lb培养基中添加250 mm甲醇，60 μg/ml卡纳抗性，在培养温度37℃下生长至od600达到0.4-0.6时，加入0.2 mm的iptg，培养周期为60 h期间每隔12 h取样用于细胞浓度的测定并用hplc测定甲醇的浓度。甲醇测定条件为，谱柱为aminex hpx-87h柱（75
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300 mm rid），流动相0.5 mm h2so4超纯水溶液，流速0.6 ml/min，样品保留时间25 min。实验结果显示敲除了基因frmabr的菌株对甲醇消耗量减少了30 mm。
20.产物产量验证，重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, sumo-alse, a6pp, δfrmabr)与重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, sumo-alse, a6pp)在添加70 mm d-木糖，160 mm甲醇，60 μg/ml卡纳抗性，30 μg/ml氯霉素抗性的lb培养基中于37℃培养至od600达到0.4-0.6，加入0.2 mm的iptg，培养时长为60 h期间每隔12 h取样测定细胞浓度并对发酵液进行hplc分析。d-木糖与d-阿洛酮糖的分析方法相同，结果显示敲除基因frmabr后， d-阿洛酮糖的产量由1.039 mm增加到2.21 mm。
21.实施例3敲除的菌株中不止一株菌，存在多种组合。将敲除基因的不同菌株进行产物发酵，最终d-阿洛酮糖的产量如下表所示，与预期相符，培养基为lb培养基，底物为70 mmd-木糖，160 mm甲醇，抗性为60 μg/ml卡纳抗性和30 μg/ml氯霉素抗性，最初发酵时细胞od600达到0.4-0.6时加入0.2 mm iptg，培养时长60 h，培养温度均为37℃，实验结果显示相比重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, sumo-alse, a6pp)，重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, sumo-alse, a6pp, δfrmabr, δrpia, δpfka, δpfkb)的d-阿洛酮糖的产量由1.039 mm提高到23.92 mm。
22.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：

1.一种大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，通过引入外源基因mdh、hps、phi、alse、a6pp，建立以甲醇和d-木糖为碳源制备d-阿洛酮糖的合成路径，通过敲除副产物途径基因frmabr、磷酸戊糖途径的关键基因rpia、以及糖酵解途径的关键基因pfka、pfkb，最终得到d-阿洛酮糖高效合成的重组菌株。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1）通过构建重组载体，在野生型大肠杆菌jm109 (de3)中表达外源蛋白mdh，hps、phi、alse、a6pp，得到重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, alse, a6pp)，建立以甲醇和d-木糖为碳源合成d-阿洛酮糖的细胞工厂；2）利用sumo标签，融合表达alse-sumo蛋白，增强alse蛋白在大肠杆菌中的表达量，在野生型大肠杆菌中分别表达外源蛋白alse、a6pp和外源蛋白alse-sumo、a6pp，得到重组菌株e. coli (alse, a6pp)和重组菌株e. coli (sumo-alse, a6pp)；进一步借助胞外酶催化实验，确定添加sumo标签对alse蛋白在大肠杆菌中高效表达的有效作用；3）敲除副产物途径基因frmabr(gene id：944988、944991、944986)，磷酸戊糖途径的关键基因rpia(gene id：947407)，以及糖酵解途径的关键基因pfka(gene id：948412)，pfkb(gene id：946230)，得到重组菌株e. coli (mdh, hps, phi, alse, a6pp, δfrmabr, δrpia, δpfka, δpfkb)，进而实现d-阿洛酮糖的高效合成。3.根据权利要求2所述的大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，步骤（1）中在大肠杆菌jm109 (de3)中表达的外源基因mdh、hps、phi，其中mdh基因来自钩虫菌，hps基因来自甲醇芽孢杆菌， phi基因来自荚膜甲基球菌，基因序列参照ncbi数据库，mdh、hps、phi基因的ncbi序列号分别为wp_013953014.1、wp_014707664、wp_064496767，alse基因来自大肠杆菌k-12菌株，a6pp基因来自脆弱拟杆菌，基因序列参照ncbi数据库，alse和a6pp基因的ncbi序列号分别为s101520_02794和bf9343_0892。4.根据权利要求2所述的大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，步骤（2）中的alse蛋白借助sumo标签进行融合表达，目的是增强alse蛋白在胞内的表达效果，大肠杆菌jm109 (de3)在37℃下培养，并诱导alse-sumo蛋白表达，4℃离心，使用ph7.0、hepes缓冲液悬浮细胞两次后，超声破碎，离心并取上清液，通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析蛋白表达效果。5.根据权利要求2所述的大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，步骤（2）中的胞外酶催化实验的反应体系为600 μl，其中果糖-6-磷酸10 mm，氯化镁5 mm，ph 7.0 hepes缓冲液100 mm，以及20μl粗酶液，酶催化实验的反应条件为温度37℃，时间25 min，取400 μl反应液，通过高效液相谱分析。6.根据权利要求2所述的大肠杆菌利用甲醇和d-木糖发酵生产d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，步骤（3）中的基因敲除按照frmabr、rpia、pfka、pfkb的顺序进行，具体敲除方法参照λ-red同源重组法。

技术总结

本发明提供一种大肠杆菌利用甲醇和D-木糖发酵生产D-阿洛酮糖的方法，利用大肠杆菌为宿主细胞，通过在野生大肠杆菌中表达外源基因甲醇脱氢酶Mdh、3-己糖-6-磷酸合成酶Hps、6-磷酸-3-己糖异构酶Phi、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶AlsE、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶A6PP，建立一条从甲醇和D-木糖到合成D-阿洛酮糖的路径。为提高AlsE蛋白的表达量引入蛋白标签SUMO。通过敲除副产物途径基因frmABR，磷酸戊糖途径的关键基因rpiA，以及糖酵解途径的关键基因pfkA，pfkB，得到一株重组菌株，实现碳源的理性控制，从而实现大肠杆菌利用甲醇和D-木糖高效合成D-阿洛酮糖。阿洛酮糖。