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MERS冠状病毒3C样蛋白酶生物学功能研究

安徽医科大学

ANHUI MEDICAL UNIVERSITY

硕士学位论文

MERS冠状病毒3C样蛋白酶生物学功能研究Biological Function-Study On3C-like protease of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus

作者姓名解晴

指导教师陈忠斌研究员

学科专业生物化学与分子生物学

论文工作日期2015年03月至2017年5月

2017年5月

本课题受：国家自然科学基金(No.81571982,No.81273231,No.81471947)资助

中英文对照表 (1)

摘要 (3)牛头饰手工制作

1引言 (10)

拉画笔2实验材料 (13)

2.1细胞株和主要质粒 (13)

2.2主要试剂 (14)

2.3主要仪器和设备 (15)

2.4常规试剂及配制 (16)

3方法 (17)

3.1SARS-CoV／NL63-CoV3CLpro及其突变体的构建 (17)

3.1.1设计引物 (17)

3.1.2定点突变PCR (18)

3.1.3PCR产物回收后消化酶切 (19)

3.1.4转化 (19)

3.1.5测序鉴定 (19)

3.2报告基因双荧光素酶活性检测法 (20)

声音定位系统3.3实时定量PCR实验 (20)

3.3.1细胞总RNA的提取 (20)

3.3.2RNA逆转录实验 (21)

3.3.3Real-time PCR (22)

3.4酶联免疫吸附实验 (23)

3.5RIG-I通路信号蛋白激活的干扰素分析 (23)

3.6Western blotting分析蛋白表达量 (24)

3.7去泛素化活性检测 (25)

3.7.1MERS3CLproDUB活性检测 (25)

3.7.2MERS3CLpro体外DUB活性检测 (25)

3.7.3MERS3CLpro对Ub-K48和Ub-K63DUB活性检测 (26)仙台病毒

3.7.4去ISG和去SUMO活性检测 (26)

3.8免疫共沉淀技术检测蛋白泛素化水平 (26)

3.9检测自噬体形成 (26)

3.9.1激光共聚焦检测自噬体形成 (26)

3.9.2电子投射电镜检测自噬体形成 (27)

3.10自噬标志蛋白LC3-II表达分析 (27)

3.11检测自噬底物蛋白p62稳定性 (27)

3.12免疫荧光技术检测自噬膜流（autophgic flux） (27)

3.13统计学分析 (28)

4结果 (28)

4.1MERS-CoV基因组结构和3C样蛋白酶 (28)

水面曲线4.23CLpro是一种新IFN拮抗剂 (29)

4.2.1不同种人类冠状病毒3CLpro均明显抑制干扰素表达 (29)收获时间到

4.2.23CLpro的干扰素拮抗活性依赖于蛋白酶催化活性 (30)

4.2.3MERS3CLpro通过RIG-I通路抑制干扰素表达 (31)

4.3MERS冠状病毒3C样蛋白酶是一种新去泛素化酶 (32)

4.3.1MERS3CLpro具有去泛素化酶（DUB）活性 (32)

4.3.2MERS3CLpro对不同连接形式泛素具有去泛素化活性 (33)

4.3.3MERS3CLpro具有去ISG活性和去SUMO活性 (34)

4.43CLpro对调节蛋白（RIG-I／TBK1／IRF3）的去泛素化作用 (35)

4.53C样蛋白酶是一种新的自噬诱导蛋白 (37)

4.5.1MERS3CLpro引起细胞eGFP-LC3B点状聚集 (37)

4.5.23CLpro诱导细胞自噬标志蛋白LC3-II表达 (37)

4.5.3电镜下观察自噬体膜结构 (38)

4.5.4MERS3CLpro诱导自噬具有时间依赖性 (39)

4.5.5MERS3CLpro诱导不完全细胞自噬效应 (40)

4.5.6NL63-CoV，SARS-CoV3CLpro可诱导细胞自噬并且不依赖酶

催化活性位点 (41)

5讨论 (42)

6结论 (45)

参考文献 (46)

个人简历 (49)

致谢 (51)

综述 (52)

综述参考文献 (60)

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