一种基于相变化的免疫层析试纸条及使用方法

1.本发明属于食品安全与品质检测领域，具体涉及一种基于相变化的免疫层析试纸条及使用方法。

背景技术：

2.食源性疾病是世界范围内的一个重要公共卫生问题。大约91％的食源性疾病是由细菌污染引起的。沙门氏菌属、弯曲杆菌属、单核细胞增生李斯特菌、金黄葡萄球菌和致病性大肠杆菌是导致食品相关疫情数量最多的主要病原体。世界各地国家及组织也已经将食品安全防控的焦点从调查食源性疾病暴发后的原因逐渐转移至主动检测和预防食品污染。食品安全检测方法需要更加快速、简便和准确。
3.核酸检测在临床诊断、基因编辑、大流行疾病预防以及各种生物医学研究中至关重要。聚合酶链反应(polymerase chain reaction)是最早的，也是目前最流行的扩增和检测低丰度核酸的扩增技术。虽然pcr已广泛应用于各个领域，但它需要精密且昂贵的热循环仪，这在很大程度上限制了pcr在资源有限的环境和即时检测(poc)分析中的应用。为了满足在条件受限的环境下信号放大的需求，已经开发了多种等温核酸扩增方法，如重组酶聚合酶扩增 (rpa)、滚环扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、以及链置换扩增(sda)等。这些等温扩增方法因操作简单、具有较快扩增速度、高灵敏度和选择性、并且能在低温和恒定温度下操作而引起广泛关注。但是，在扩增过程中，二聚体与非靶扩增子的形成等非特异性现象会造成假阳性结果，因而寻一种高特异性识别靶序列的分析方法是非常有必要的。
4.基于聚类规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats，crispr)相关核酸酶(cas)检测是一种很有前景的核酸检测新方法。已有很多工作报道，cas效应蛋白被用作高度特异性的序列识别元件，与等温扩增技术相联用，结合不同的信号读取方式进行现场检测，极大提高了核酸检测的特异性和准确度。目前，基于 crispr/cas12a结合等温扩增较为常见的信号输出的方式有：(1)被靶标激活的cas12a无差别切割荧光基团和淬灭基团标记的ssdna在紫外激发下产生荧光信号；(2)利用cas12a 切割ssdna，结合aunps的局部表面等离子共振现象实现颜变化；(3)切割电化学活性物标记的dna探针实现电化学信号输出；(4)结合侧流层析试纸条上测试线和质控线显变化实现肉眼可视读取。其中，侧流层析试纸条具有易于携带、性价比高、使用方便、反应速度快等优点，在现场检测领域得到了广泛的应用。但是，目前已报道的用于与crispr/cas 结合使用的侧流层析试纸条研究中，测试线信号大多是通过anti-fitc标记的信号探针(aunps、qbs等)捕获fitc-ssdna-biotin得以呈现，测试线信号呈“turn off”模式—与竞争法侧流层析试纸条分析结果类似。但是“turn off”比“turn on”信号输出模式灵敏度低，并且不利于对结果进行判读和理解。为了解决这一问题，许多工作将质控线(c线)、测试线位置对调，使得测试线信号呈“turn on”模式，但是存在的问题是：1)需确保没有靶标出现时，结合垫上的探针刚好完全被质控线(原测试线)捕获，靶标出现时ssdna被剪断，释放探针被测试线(原质控线)捕获，从而才能呈现turn on”模式，这无疑增大试纸条研发期间的工作
量。2)质控线和测试线位置的调换易给非专业人员带来逻辑上的理解障碍，易造成结果的误判。此外，胶体金作为侧流层析试纸条常用的一种信号探针，存在灵敏度低和难以定量的问题，这也是在实际应用急需解决的一大问题。
5.一般地，通过肉眼判读胶体金试纸条测试线颜的强弱时，只能得出“是”或“否”的定性结果，难以实现裸眼半定量或定量。人的肉眼有三种不同类型的锥细胞，它们对不同波长的光的反应模式不同。相由这三种锥细胞的单个信号计算和积分，因此比亮度更容易识别，所以相是肉眼读数的最佳选择。此外，相随三基(红-绿-蓝(r-g-b))的强度变化而变化，因此可以利用不同颜(如r/g)的信号强度比来定量目标浓度。

技术实现要素：

6.本发明提供了一种基于相变化检测食源性致病菌的免疫层析试纸条及方法，具体包括以下几个步骤：
7.(1)免疫层析试纸条的组装；
8.(2)提取待测样品的基因组dna；
9.(3)对待测样本进行恒温扩增；
10.(4)利用crispr/cas12a对核酸扩增产物进行切割；
11.(5)采用免疫层析试纸条进行检测；
12.(6)对免疫层析试纸条检测结果进行定性及半定量判读。
13.所述步骤(1)中用于检测食源性致病菌核酸的免疫层析试纸条，其长为6～8cm，宽为3 ～4mm，其结构包括ps底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫(图1、图2)。
14.所述ps底板作为侧向流动试纸条的骨架，用于粘贴并固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
15.所述样品垫1为玻璃纤维膜构成，固定在试纸条的起始端，作为试纸条与样品直接交流的窗口，用于样品的滴加。
16.所述结合垫2固定在样品垫1和硝酸纤维素膜6之间，结合垫2两侧分别与样品垫1和硝酸纤维素膜6有2-3mm的重叠。所述结合垫表面喷涂了抗体2标记的红荧光微球。
17.所述硝酸纤维素膜6是检测结果的呈现窗口，划了质控线(c线)和测试线(t线)。所述质控线靠近吸水垫一端，固定了抗体1对应的二抗；所述测试线靠近结合垫一端，固定了抗体1和绿荧光微球。所述质控线和测试线的距离为4～6mm。
18.在硝酸纤维素膜(6)上设置测试线(3)和质控线(4)的方法为：取绿荧光微球gsqs 离心并重悬在含1％w/v tween-20的pbs缓冲溶液中，加入抗体1溶液并超声混匀，得到gsqs
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抗体1混合溶液，即为测试线溶液；将测试线溶液和质控线溶液(即抗体2对应的二抗溶液，浓度为1mg/ml,10mm ph 7.4pbs)分别以1μl/cm的速度，用三维平面点膜喷金仪在硝酸纤维素膜上划线，烘干后即得测试线和质控线。
19.所述吸水垫5为待测液流动提供动力，在试纸条的最末端。
20.所述抗体1为链霉亲和素、抗抗体等其他通用抗体中的一种，所述抗体2为链霉亲和素、抗抗体等抗体中的一种，且抗体1和抗体2为不同种类的抗体。所述抗原1 和抗原2分别对应抗体1和抗体2，抗原1和抗原2为生物素、等其他通用抗原标签中的一种。所述绿荧光微球优选但不限于dsio2@gqds@sio2(gsqs)，所述红荧光微球优选
但不限于dsio2@aunps@sio2@rqds(saq)。所述红荧光微球的吸收光谱与所述绿荧光微球的发射光谱存在较大重叠，所述绿荧光微球发射的荧光能被所述红荧光微球吸收(内滤效应)，导致所述绿荧光微球发光难以被观察到，颜变化更明显。所述红荧光微球以树状sio2(dsio2)为模板、aunps和rqds逐层自组装和包封的复合纳米材料。所述测试线上的内滤效应主要是由红荧光微球saq中aunps的最大吸收(533nm)和gsqs 的发射(525nm)有较好重叠而实现的。在已发表的工作中，同样利用到了红荧光微球saq 与gqds之间的内滤效应导致测试线信号反向双向变化。但是，在先前工作体系中，测试线是基于单个gqds与saq之间的内滤效应，而该工作中，是把大量gqds模板化自组装到dsio2中，绿荧光发射更强，意味着内滤效应更强即变更为灵敏，并且组装之后的gsqs的光学性质比经过两性配体交换得到的水溶性gqds更稳定，不易发生荧光淬灭。
21.所述步骤(2)中样品基因组dna的提取方法包括但不限于柱层析法、酚抽提法、碱裂解法、ctab裂解法、磁珠提取法等。
22.所述步骤(3)中对样本进行核酸扩增的方法包括但不限于重组酶聚合酶等温扩增(rpa)、滚环扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、以及链置换扩增(sda)等。
23.所述步骤(4)中利用crispr/cas12a对核酸扩增产物进行切割条件优选为：100～500nmcas12a、150～550nm crrna、10～200nm抗原1和抗原2同时标记的单链dna、2～6μl扩增产物。所述crispr/cas12a对核酸扩增产物进行切割反应的切割缓冲液包含tris-hcl缓冲液(5 ～50mm，ph 7.9)、mgcl2(5～15mm)、nacl(5～100mm)。切割温度包括但不限于30 ～40℃，切割时间包括但不限于10～30分钟。所述ssdna探针为抗原1和抗原2同时修饰的寡核苷酸，包括但不限于5
’‑
digoxin-tttttttttttttt-biotin-3’、 5
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biotin-tttttttttttttt-digoxin-3’、5
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digoxin-ttttttttt-biotin-3’、 5
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digoxin-tttatttatttatt-biotin-3’等。
24.所述步骤(5)中采用免疫层析试纸条进行检测原理为：当待测样品中存在待测病原菌时，其特征基因经核酸扩增后产生大量的扩增产物并特异激活crispr/cas12a侧切活性，切割抗原1和抗原2标记的ssdna探针，使得抗体2修饰的红荧光微球不能通过该探针固定在测试线上，测试线呈绿。相反的，当样品中不含待测病原菌时，cas12a的侧切活性未激活，抗体2修饰的红荧光微球通过抗原1和抗原2标记的ssdna探针被测试线上的抗体1捕获，测试线变为红。随着待测病原菌浓度的增加，测试线信号呈现出红——红橙——黄绿——绿的相变化趋势，根据不同的测试线颜能够读出特定的浓度，从而实现待测病原菌的半定量检测。
25.所述步骤(5)中采用免疫层析试纸条进行检测的方法为：在所述步骤(4)的反应产物中加入稀释缓冲液(1mm mgcl2，4mm tris-hcl，ph 7.4)稀释，其中crispr反应产物与稀释缓冲液的最终体积比为1∶2～1∶5，之后将稀释产物滴加在试纸条样品垫上，层析10～15 分钟。用波长为350nm的紫外激发光对划线区域进行照射，观察颜变化情况。
26.所述步骤(6)中对免疫层析试纸条检测结果进行半定量分析的方法为：采用一系列已知浓度的样品按照从所述步骤(2)到步骤(5)的方法进行检测，用波长为365nm的紫外激光对测试线和质控线进行照射，并用手机软件读取测试线上的相值、制作标准比卡。采用从步骤(2)到步骤(5)的方法对待测样品进行检测，并将侧向流动试纸条检测的结果与所述比卡进行肉眼比对，实现待测样品的半定量检测。
27.所述步骤(6)中对免疫层析试纸条检测结果定性判读的方法为：
28.当样品中存在待测致病菌时，肉眼观察到测试线呈现绿、黄绿，r/g值小于2.0。
29.当样品中不存在待测致病菌时，肉眼观察到测试线为明显的红，r/g值大于2.0。
30.本发明的有益效果
31.(1)本发明提供一种将免疫层析试纸条与核酸扩增、crispr/cas12a特异结合实现病原菌检测的方法，相比于常规核酸扩增与免疫层析试纸条结合的方法，本方法通过引入 crispr/cas12a能够提高检测结果的特异性。
32.(2)本发明提供的相变化试纸条与常规胶体金试纸条相比，其结果的呈现是测试线从一种颜向另一种颜过渡，通过人眼对相变化的敏感性强于对度变化的敏感性，结合标准比卡，无需借助仪器即可读出样本中目标病原菌的含量，实现半定量检测。
33.(3)本发明的相变化的原理是通过不同荧光发射的纳米粒子的颜叠加和内滤效应实现，相比于普通的颜叠加的原理具有更为明显的颜变化。
34.(4)将胶体金试纸条与crispr/cas12a结合用于核酸目标物检测时，常规方案是将质控线设置在更靠近样品垫的一端，使得ssdna探针携带信号标签在流经质控线时被完全截留，而测试线无法捕获到信号标签。当阳性样品中的目标序列激活crispr/cas12a导致ssdna探针断裂后，信号标签因不能通过ssdna固定到质控线而“逃逸”至测试线，导致测试线产生颜变化，呈“turn on”模式。但是，该方法不仅需要精准控制ssdna探针的量以避免检测结果的假阳性，也容易给非专业人员带来逻辑上的理解障碍，造成结果的误判。本发明的相变换试纸条与crispr/cas12a结合时无需改变质控线和测试线的位置，更符合使用者的使用习惯，不易造成结果误判。且样本在测试过程中，先流经测试线，再流经质控线，所用抗原1 和抗原2同时标记的ssdna探针的浓度可显著低于胶体金试纸条，而不产生假阳性信号。
35.(5)与商业化胶体金试纸条相比，本发明基于相变化的试纸条对沙门氏菌dna检测灵敏度高10倍，并且使用浓度较少的digoxin-ssdna-biotin即可实现沙门氏菌dna的灵敏检测，不会出现假阳性结果；而商业化胶体金试纸条需要使用更高浓度的fam-ssdna-biotin，使得阴性样本在在检测时aunps流经质控线时刚好完全被链霉亲和素捕获，否则会出现假阳性结果。
附图说明
36.图1为本发明试纸条剖面示意图。图中，1为样品垫；2为结合垫，喷涂抗抗体标记的saq，3为测试线；4为质控线；5为吸水垫；6为硝酸纤维素膜；7为ps底板。
37.图2为本发明试纸条俯视示意图。
38.图3为测试线划膜溶液中不加tween-20和加入tween-20的对比图，(a)图不加tween-20，(b)图加入了tween-20。
39.图4为ssdna探针浓度的影响。
40.图5为测试线上固定的链霉亲和素浓度的影响。
41.图6为抗抗体用量的影响。
42.图7为12相环。
μl氨水，剧烈搅拌12h，以制备巯基化的dsio2@aunps@sio2。反应结束后，离心收集沉淀，并用乙醇洗涤3次。随后，在沉淀中加入1.0ml含有rqds氯仿溶液，并超声5分钟，以获得均匀分散的溶液。通过8000～12000rpm离心5分钟得到dsio2@aunps@sio2@rqds沉淀，并用氯仿洗涤一次以除去过量的rqds。
60.(6)二氧化硅包覆的dsio2@aunps@sio2(saq)的合成。
61.在超声条件下，将dsio2@aunps@sio2@rqds沉淀分散在200μl otms中，然后加入含有20ml甲醇和450μl氨水的混合液，继续超声30分钟。以10000rpm离心收集沉淀，并用甲醇洗涤一遍以除去过量的otms，随后分散在45ml水和75μl氨水中，搅拌18h，以沉积二氧化硅薄层。离心后，将沉淀重新分散在40ml乙醇，7.5ml水和700μl氨水的混合物中，每1h 向其中注入25μl teos，通过方法继续包覆二氧化硅。3h后，通过离心获得saq，并用乙醇洗涤3次。
62.(7)羧基化saq的合成。
63.首先，将saq沉淀重新分散在25ml乙醇，5ml氨水和25μl 3-氨丙基三乙氧基硅烷 (aptes)的混合溶液中，在室温下搅拌12h，以制备氨基化的saq。反应结束后，将沉淀离心，用乙醇洗涤，然后再分散在20ml的含0.25mol/l丁二酸酐的dmf溶液中，在室温下搅拌24h。最后通过离心收集羧基化的saq，并用乙醇洗3遍，最后分散在超纯水中备用。
64.实施例2saq标记抗抗体。
65.(1)活化：将1mg的羧基化saq、1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc) 和1mg的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)溶解在1ml的pb(0.01m，ph6.0)缓冲液中，并在摇床上37℃孵育30分钟。
66.(2)偶联：将上述溶液离心，并将其重新悬浮于1ml pb(0.01m，ph7.4)溶液中，并向其中加入50μg抗抗体，反应进行2.5h。
67.(3)封闭：加入100μl的含有10％w/v bsa的封闭液，封闭2h。
68.(4)重悬：封闭完成后的微球溶液离心，重悬保存在0.5ml的含2.5％w/v bsa，1％w/v 蔗糖的pb(0.02m，ph 7.4)缓冲溶液中。
69.实施例3绿荧光微球dsio2@gqds@dsio2(gsqs)的合成。
70.(1)树状二氧化硅(dsio2)的合成。同实施例1中步骤(1)。
71.(2)树状二氧化硅巯基化(dsio
2-sh)。将4ml氨水和1ml mptms添加到含dsio2的乙醇溶液中，在室温条件下剧烈搅拌12h后，通过离心收集巯基化的dsio2，并用乙醇洗涤3 次，然后将得到的巯基化的dsio2重新分散在50ml的乙醇中。
72.(3)dsio2@gqds的合成。将0.5ml绿荧光cdznse/cds/zns qds(gqds)的氯仿溶液添加到5mg巯基化dsio2沉淀中，并将所得混合物超声5分钟，得到分散均匀的溶液。通过 10000rpm离心5分钟得到dsio2@gqds，并用氯仿洗去过量的gqds。
73.(4)dsio2@gqds@sio2的合成。在超声条件下，将dsio2@gqds沉淀分散在100μl otms 中，然后加入含有5ml甲醇和200μl氨水的混合液，继续超声30分钟。通过10000rpm离心收集沉淀，并用甲醇洗一遍以除去过量otms，随后分散在20ml水和35μl氨水中，搅拌18h，以沉积二氧化硅薄层。离心后，将沉淀重新分散在15ml乙醇，5ml水和1μl氨水的混合物中，每1h向其中注入10μl teos，通过方法继续包覆二氧化硅。10h后，通过离心收集得到gsqs沉淀，并用乙醇洗3次。
74.(5)gsqs羧基化。将上述gsqs沉淀重新分散在10ml乙醇，0.25ml氨水和10μl aptes 的混合溶液中，在室温下搅拌12h，以制备氨基化的gsqs。反应结束后，将沉淀离心，用乙醇洗涤，然后再分散在5ml的含0.1mol/l丁二酸酐的dmf溶液中，在室温下搅拌24h。最后通过离心收集羧基化的gsqs，并用乙醇洗3遍，最后分散在超纯水中备用。
75.实施例4基于相变化的侧流层析试纸的具体制备。
76.(1)结合垫、样品垫前处理：
77.首先用含有1％w/v bsa，2.5％w/v蔗糖，0.5％w/v tween-20的pb(0.02m，ph7.4)缓冲液处理玻璃纤维膜，并在37℃下干燥12小时。
78.(2)划线：
79.先将免疫硝酸纤维素膜按照开线尺寸固定在ps底板上(再划线)；
80.然后制备gsqs、链霉亲和素混合液(测试线溶液)。取25μg gsqs羧基化微球离心并重悬在25μl含1％w/v tween-20的pbs(10mm，ph7.4)缓冲溶液中，加入25μl 5mg/ml链霉亲和素溶液并超声混匀，使混合溶液中链霉亲和素终浓度为2.5mg/ml，gsqs终浓度为0.5 mg/ml。
81.将制得的gsqs-链霉亲和素混合溶液(测试线溶液)和浓度为1mg/ml兔抗绵羊多克隆抗体溶液(0.01m pbs，ph7.4，质控线溶液)分别以1μl/cm的速度，用三维平面点膜喷金仪向硝酸纤维素膜上划线，测试线和质控线的间距控制在4mm左右；将硝酸纤维素膜在37℃下烘干12小时，放置干燥柜中保存备用。
82.(3)结合垫喷涂信号标签：将制得的saq标记抗抗体用含2.5％w/v bsa，1％w/v 蔗糖的pb(0.02m，ph7.4)缓冲液稀释至2mg/ml，以5μl/cm的速度将信号标签(稀释后的saq标记抗抗体)喷涂在经过步骤1处理的玻璃纤维膜上，并在37℃下干燥12小时，放置干燥柜中保存备用。
83.(4)组装：将结合垫裁切至0.7cm左右，将结合垫贴于硝酸纤维素膜上方，与膜接触2mm；将样品垫裁切至2cm，贴于结合垫上方；将吸水纸贴在硝酸纤维素膜的上方，与膜接触2mm；将组装好的试纸条底板放置切割机平台轨道中，正面朝上，整体切成宽度为0.38cm的具有相变化的核酸试纸条，其中结合垫长度0.7cm，样品垫长度2cm。
84.如图3所示为在测试线划膜溶液中不加tween-20和加入tween-20时，测试线颜变化的变化情况：当不加tween-20，直接用pbs缓冲液配制测试线溶液(gsqs+链霉亲和素)时，测试线颜特别不均匀，出现了明显的分层现象，可能的原因是gsqs和链霉亲和素不能很好的分散在划线区域；而加入了1％表面活性剂tween-20之后，测试线颜不均匀现象得到明显的改善，并且测试线的信号也得到了很大的提高，原因可能是表面活性剂的加入使gsqs和链霉亲和素充分且均匀地分布在测试线区域，蛋白结合位点也得以充分暴露。
85.实施例5基于相变化的核酸试纸条实验条件优化。
86.(1)优化两端分别被和生物素修饰的ssdna探针的最佳浓度。结果如图4所示，当ssdna探针浓度为20nm时，测试线r/g值达到饱和，随着ssdna探针浓度大于100nm时，测试线的信号逐渐下降，产生明显的“hook”效应，原因可能是过量的ssdna探针占据测试线上的链霉亲和素结合位点，导致被anti-digoxin-saq捕获的ssdna探针不能完全被测试线截留，从而测试线r/g信号减小。
87.(2)优化测试线上链霉亲和素的最佳浓度。结果如图5所示，随着链霉亲和素浓度
的增加，测试线r/g值逐渐增加，当链霉亲和素浓度为2.5mg/ml时，测试线r/g值达到饱和，因而选择2.5mg/ml为最佳浓度。
88.(3)优化saq微球偶联抗抗体的最佳用量。按1mg saq微球所用的抗体用量来进行优化，结果如图6所示，随着抗体的用量增加，测试线的r/g值逐渐增加，理论上，r/g 值在3～4之间相变化较为灵敏，当抗体用量为20～25μg时，测试线r/g值较为理想。
89.实施例6采用沙门氏菌的rpa引物扩增待测样本中沙门氏菌。
90.(1)按照下列表1配制rpa等温扩增反应体系：
91.表1
92.组分用量a buffer29.4μl引物f(10μm)2μl引物r(10μm)2μlddh2o12.1μl待测样本dna提取液2μl
93.(2)将上述反应体系充分混匀，打开rpa的反应单元，向各反应单元的管盖上加入2.5μl 醋酸镁溶液，充分混匀并离心；
94.(3)反应管在37℃条件下反应20～30分钟，反应完成后立即将反应管置于冰上备用。
95.上述rpa引物序列为：
96.引物f：5
’‑
gtcattccattacctacctatctggttgatttcc-3’；
97.引物r：5
’‑
gcatcggcttcaatcaagataagacgactggt-3’。
98.实施例7crispr/cas识别沙门氏菌扩增产物。
99.20μl的扩增体系为：cas12a浓度为200nm，crrna的浓度为250nm，ssdna探针的浓度为20nm，扩增产物体积为2μl，及切割缓冲液(10mm tris-hcl，ph 7.9，50mm nacl，10 mm mgcl2，100μg/ml bsa)，用depc水补足，30～40℃反应10～30分钟，反应完成后立即将反应管置于冰上备用。
100.用于沙门氏菌检测的crrna序列为： 5
’‑
uaauuucuacuaaguguagauuggggucguucuacauugac-3’；
101.ssdna探针的序列为5
’‑
digoxin-tttttttttttttt-biotin-3’；
102.实施例8基于免疫层析试纸条的相变化对沙门氏菌进行半定量分析
103.如图12所示，用稀释缓冲液稀释(1mm mgcl2，4mm，tris-hcl，ph7.4)实施例(7) 中的反应产物，其中crispr反应产物与稀释缓冲液的体积比为1：3，将稀释液滴加在试纸条样品垫上，层析10分钟。用波长在365nm的紫外激发光对划线区域进行照射，观察颜变化情况，并用手机软件color picker读取测试线r、g信号值。
104.基于相变化的试纸条结果判定方法如下：
105.阴性：测试线呈红，质控线呈微弱红，r/g值大于2.0。
106.阳性：测试线为绿，质控线为较明显的红，r/g值小于2.0时。
107.无效：质控线不显。
108.半定量结果参考12相环(图7)，沙门氏菌检测结果如图8所示，呈现如下：当样本
中不存在沙门氏菌基因组dna时，测试线为红，hsb值在330度～360度之间；当沙门氏菌基因组dna浓度为1copies/μl时，测试线为红橙，r/g值为2.0左右，hsb值在300度～330度之间；当沙门氏菌基因组dna浓度为5～10copies/μl时，测试线为黄绿，r/g值为0.7左右，hsb 值在240度～270度之间；当沙门氏菌基因组dna浓度为20～100copies/μl时，测试线为绿， r/g值为0.4左右，hsb值在210度～240度之间；当沙门氏菌基因组dna浓度为100～10
4 copies/μl时，测试线呈绿，r/g值为0.2左右，hsb值在210度～240度之间。根据上述实验结果，制作标准比卡，如图9所示。
109.实施例9使用商品化胶体金试纸条对比检测
110.crispr/cas12a的切割体系为20μl，包括200nm cas12a、250nm crrna、500nmfam-ssdna-biotin、切割缓冲液(10mm tris-hcl，ph 7.9，50mm nacl，10mm tris-hcl， 10mm mgcl2，100μg/ml bsa)及2μl扩增产物。37℃反应15min。将crispr/cas12a的切割产物稀释至50μl，将试纸条插入pcr管中反应，5min后读取结果。
111.商品化胶体金试纸条将质控线、测试线位置对调，意味着ssdna的浓度要完全过量，否则结合垫上的anti-fam-aunps不能完全被质控线上的链霉亲和素捕获，导致测试线出现假阳信号。当将相变化试纸条使用的ssdna浓度20nm使用到胶体金试纸条中时，rpa和cas12a 识别切割、试纸条检测实验步骤与实例6、7、8相同。当样本溶液中不含沙门氏菌基因组dna 时，测试线仍出现较强信号，实验结果如图10所示，由此说明ssdna浓度较低时容易出现假阳性信号。经过一系列浓度优化后，ssdna浓度提高到200nm后，重新进行了切割和试纸条检测，结果如图11所示，当沙门氏菌基因组dna浓度为10copies/μl时，测试线才出现明显信号，而基于相识别的试纸条可检测浓度低至1copies/μl的沙门氏菌基因组dna(实施例8)。

技术特征：

1.一种基于相变化的免疫层析试纸条，其特征在于，包括ps底板(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(6)和吸水垫(5)，在ps底板(7)表面的起始端至末端依次粘贴有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(6)和吸水垫(5)，结合垫(2)两侧分别与样品垫(1)和硝酸纤维素膜(6)重叠，对于两个重叠部分，结合垫(2)位于样品垫(1)下方，硝酸纤维素膜(6)位于结合垫(2)下方；硝酸纤维素膜(6)与吸水垫(5)部分重叠，对于重叠部分，硝酸纤维素膜(6)位于吸水垫(5)下方；所述样品垫(1)为玻璃纤维膜，待测样品滴加于样品垫(1)上；所述结合垫(2)表面喷涂有抗体2标记的红荧光微球；所述硝酸纤维素膜(6)作为结果的呈现窗口，设置有测试线(3)和质控线(4)，测试线(3)和质控线(4)之间的距离为4～6mm；测试线(3)靠近结合垫，固定有抗体1和绿荧光微球；质控线靠近吸水垫，质控线(4)上固定有抗体1对应的二抗。2.根据权利要求1所述的一种基于相变化的免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗体1为链霉亲和素、抗抗体中的一种，所述抗体2为链霉亲和素、抗抗体中的另一种，抗体1和抗体2为不同种类的抗体。3.根据权利要求1所述的一种基于相变化的免疫层析试纸条及使用方法，其特征在于，所述绿荧光微球为dsio2@gqds@sio2，是以dsio2为模板，gqds自组装和包封的复合纳米材料；所述红荧光微球为dsio2@aunps@sio2@rqds，是以dsio2为模板、aunps和rqds逐层自组装和包封的复合纳米材料。4.根据权利要求1所述的一种基于相变化的免疫层析试纸条，其特征在于，在硝酸纤维素膜(6)上设置测试线(3)和质控线(4)的方法为：取绿荧光微球gsqs离心并重悬在含1％w/v tween-20的pbs缓冲溶液中，加入抗体1溶液并超声混匀，得到gsqs-抗体1混合溶液，即为测试线溶液；将测试线溶液和质控线溶液分别以1μl/cm的速度，用三维平面点膜喷金仪在硝酸纤维素膜上划线，烘干后即得测试线和质控线。5.采用权利要求1～4任一所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)提取待测样品的基因组dna；步骤2)对待测样本进行恒温扩增；步骤3)利用crispr/cas12a对核酸扩增产物进行识别与切割；步骤4)采用免疫层析试纸条对步骤3)的反应产物进行检测；步骤5)对免疫层析试纸条检测结果进行定性及半定量判读。6.根据权利要求5所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，所述步骤3)中，利用crispr/cas12a对核酸扩增产物进行切割的反应条件为：cas12a、crrna、抗原1和抗原2同时标记的单链dna、步骤2)的扩增产物、切割缓冲液；切割温度为30～40℃，切割时间为10～30min。7.根据权利要求6所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，
所述ssdna探针为抗原1和抗原2同时修饰的寡核苷酸，包括5
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digoxin-tttttttttttttt-biotin-3’、5
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biotin-tttttttttttttt-digoxin-3’、5
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digoxin-ttttttttt-biotin-3’或5
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digoxin-tttatttatttatt-biotin-3’；所述抗原1和抗原2分别对应抗体1和抗体2，抗原1和抗原2为生物素、中的一种。8.根据权利要求5所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：在步骤3)反应后的产物中加入稀释缓冲液稀释，其中反应产物与稀释缓冲液的体积比为1∶2～1∶5，之后将稀释后的产物滴加在免疫层析试纸条的样品垫上，层析10～15分钟；用波长为350nm的紫外激发光对划线区域进行照射，观察测试线颜变化情况，并用手机软件color picker读取测试线的相值。9.根据权利要求5所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，所述步骤(5)中对免疫层析试纸条检测结果定性判读的方法为：当样品中存在待测致病菌时，肉眼观察到测试线呈现绿或黄绿；当样品中不存在待测致病菌时，肉眼观察到测试线为明显的红；所述步骤(5)中对免疫层析试纸条检测结果进行半定量分析的方法为：将检测结果的颜和相值与标准比卡上的颜和相值进行目测比对，标准比卡上与检测结果最接近的颜或相值所对应的浓度作为样品中食源性致病菌的浓度，实现待测样品的半定量检测。10.根据权利要求9所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，所述标准比卡的制备方法具体为：按照步骤1)～步骤4)的方法对浓度范围在0～1、5～10、20～100、100～104copies/μl之间的样品进行检测，用波长为365nm的紫外激光对测试线和质控线进行照射，读取测试线上的相值，扫描测试线的显结果制作对应的标准块，将所有标准块按样品的浓度依次排列、粘贴，并在标准块处标注对应的相值，制得标准比卡。

技术总结

本发明提供一种基于相变化的免疫层析试纸条及使用方法。本发明的免疫层析试纸条的测试线上固定绿荧光微球和抗体1，结合垫喷涂抗体2修饰的红荧光微球；检测病原菌的主要原理为：待测病原菌特征基因经核酸扩增后产生的特异产物激活CRISPR/Cas12a的侧切活性，导致抗原1和抗原2标记的ssDNA断裂，使其流经试纸条测试线时无法固定红荧光微球，测试线呈绿；无目标病原菌的样品因无法激活CRISPR/Cas12a，不能切割ssDNA，红荧光微球偶联ssDNA，并通过抗体1识别ssDNA上的抗原1而被固定在测试线上，使测试线呈红；根据测试线颜过渡变化，可肉眼判别目标病原菌的含量，实现半定量检测。实现半定量检测。实现半定量检测。