一．间羟基联苯比法
1.原理：多聚己糖醛酸与含四硼酸钠的硫酸溶液在高温作用下水解, 水解产物进一步与间羟基联苯反应, 生成粉红衍生物, 产生紫外吸收, 且在一定浓度范围内, 该衍生物吸收值与糖醛酸含量呈线性关系, 可通过比法对糖醛酸含量进行计算。 2.试剂配制：
间羟基联苯溶液：称取0.15g间羟基联苯溶于5 mg/mL氢氧化钠溶液中, 定容至100mL, 其质量浓度为1.5mg/mL.
四硼酸钠/硫酸溶液： 0.478g四硼酸钠溶于100mL浓硫酸中, 备用。
葡萄糖溶液：称取葡萄糖25.00mg,加水溶解并定容至25mL混匀, 成1mg/mL的标准溶液。(排除中性糖对测定结果的影响) 半乳糖醛酸标准溶液：称取干燥至恒重的半乳糖醛酸25.00 mg, 加水溶解并定容至25mL, 混匀, 成1mg/mL的标准溶液。
水牌制作3. 波长扫描：取半乳糖醛酸标准溶液0.50mL, 置10 mL容量瓶中, 用水定容至刻度, 摇匀( 质量浓度为0.05 mg/mL）。量取溶液1.00 mL 置于20 mL具塞试管, 置冰水浴中, 加入四硼酸钠/硫酸溶液6 mL, 待全部加完后, 用旋涡混合器混匀, 于沸水浴中加热5 min, 冰水浴中冷却后用微量加样加入1.5 mg/mL间羟基联苯溶液100 μL, 混匀后振摇5 min, 超声除去气泡。以1 mL蒸馏水同上操作制得空白液调零, 用UV-2450 型紫外可见分光光度计在200 nm~ 800 nm波长范围内扫描, 确定最大吸收波长。
4. 标准曲线的制备：取1mg/mL 半乳糖醛酸标准溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL和0.6 mL置于10 mL容量瓶中, 加水定容, 再分别取上述各配制溶液1.0mL至于20mL具塞试管，置冰水浴中, 加入四硼酸钠/硫酸溶液6 mL, 待全部加完后, 用旋涡混合器混匀, 于沸水浴中加热5 min, 冰水浴中冷却后用微量加样加入1.5 mg/mL间羟基联苯溶液100 μL, 混匀后振摇5 min, 超声除去气泡。以1 mL蒸馏水同上操作制得空白液调零,在最大吸收波长处测定吸光度。
5.样品测定：取样品5 mg置100 mL容量瓶, 加水溶解定容至刻度。取溶液1.00 mL按标准曲
线项方法操作。
6.中性糖影响：在一定浓度半乳糖醛酸标准溶液中, 添加不同质量的中性糖（以葡萄糖为例）播放路, 测得加入不同质量浓度的中性糖对半乳糖醛酸溶液吸光度的影响。
二．高效液相谱法A
1.标准溶液的制备：
精密称取半乳糖醛酸对照品205. 4 mg,置50mL容量瓶中,加超纯水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1 mL中含半乳糖醛酸4. 108 mg) 。精密吸取上述对照品溶液1.0、2.0、3.污水处理方法0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0mL置于25 mL容量瓶中,加超纯水稀释至刻度,摇匀,制得0.116432、0.132864、0.149296、0.165728、0.18216、0.198592、1.115024、1.131456、1.147888 mg/mL的系列标准溶液。
2.标准曲线的绘制：
取配制好的半乳糖醛酸系列标准溶液,分别进样20μL,按下面谱条件测定半乳糖醛酸峰面
积,以半乳糖醛酸峰面积为纵坐标, 对照品浓度(mg/mL)为横坐标,绘制标准曲线。求得回归方程。
3.谱条件
谱柱: Sugar-PakⅠ (300 mm ×3600s6. 5 mm) ,流动相: 0. 0001 mol/L EDTA水溶液,流速: 0. 6 mL /min,示差检测器,柱温: 90 ℃,示差检测池温度: 40 ℃,进样量: 20μL。理论板数:以半乳糖醛酸峰计算,不得低于3000。
高效液相谱法B
谱条件 谱柱：ZORBAX SAX 4.6×250mm 5-Micron Agilent ； 柱温：40℃；流动相：0.7mol/l乙酸；流速：1.0ml/min；测定波长：示差检测；示差检测器温度：40℃；进样量：20μL。
标准曲线的绘制：称取古洛糖醛酸标准品，用重蒸水溶解，配制成浓度为1.07、2.14、3.21、5.35、10.7mg/mL的标准溶液。分别进样10μL进行HPLC测定，以峰面积为纵坐标，相应标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线进行线性回归。
高山林 样品处理与检测：准确称取300mg（精确至±0.0001）海藻酸钠或者海藻，加入72%硫酸溶液3.5mL，于研钵中研磨2h，用100mL 蒸馏水将其转移至250mL三角瓶，100℃沸水浴加热2.5h，于自来水中冷却至室温，加入过量BaCO3粉末，充分反应至溶液pH 为7左右，3000r/min离心，沉淀用150mL 蒸馏水洗涤3次，将上清液和洗涤液合并在一起，45℃真空旋转浓缩后，定容至10mL，进样10μL进行HPLC测定。依据样品测定的峰面积和出峰时间，在相应的标准曲线查出所测组分的量，结合所取样品的质量和定容体积，计算出各组分的含量。
三．咔唑—硫酸比法（修改后）
1. 原理：半乳糖醛酸在硫酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红化合物，其呈强度与半乳糖醛酸含量成正比，可比定量。
2. 对照品溶液的配制：精密称取干燥至恒重的半乳糖醛酸19. 8 mg，用适量的蒸馏水溶解，并定容于100 ml 容量瓶中，配成198 μg /ml 的对照品溶液。使用时稀释至99μg/ml。
四硼酸钠-硫酸溶液的配制:精密称取0.956 g 四硼酸钠溶解于200 ml 浓硫酸中，超声溶解，备用。
咔唑溶液的配制：精密称取咔唑100 mg，溶解于100 ml无水乙醇中，配制成0.1%的咔唑溶液备用。集装箱内衬袋
4.半乳糖醛酸标准曲线制备：分别精密吸取对照品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml溶液置于10 ml 具塞试管中，各管加水至0.5 ml，分别在冰水浴中加入四硼酸钠－ 硫酸溶液3ml，用漩涡混合器混匀，于沸水浴中加热5 min，取出后立即冷却至室温，加0.1%咔唑溶液0.1 ml，摇匀，煮沸5min，冷却至室温后在530nm处测定其吸光度。以浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标进行线性回归。
方法学考察：
⑤精密度试验 取同一对照品溶液,重复测定5 次。
⑥稳定性试验 取同一供试品溶液,每隔30min 测定1 次，共测定2h 。
⑦重现性试验 取同一批号样品多糖5 份,按测定法操作。
⑧加样回收率试验 精密称取已知含量多糖5份,分别精密加入葡萄糖醛酸对照品适量,测定吸收度,计算回收率。
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