做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！
忘记从哪⾥转载来的⽂章了，并做了部分改动。⾸先对作者表⽰深深的歉意，如果将来作者本⼈认领了，请及时留⾔或联系，我必将标注来源。
做好Western需要注意各种细节。⼯欲善其事，必先利其器，⾸先还是从蛋⽩提取开始谈起。
壹：蛋⽩提取
⼀、细胞蛋⽩的提取三角形算法
1.收样前3min先配制细胞裂解液（现配现⽤），RIPA：蛋⽩酶抑制剂：磷酸酶抑制剂=99:1:1。6孔板收集蛋⽩每孔需200ul，计算⽤量。以收集六孔蛋⽩为例，按⽐例加⼊RIPA 1200ul，蛋⽩酶抑制剂12ul，磷酸酶抑制剂12ul，混匀后置于冰上。（我使⽤的试剂RIPA裂解液（中），蛋⽩酶抑制剂混合物（100×），蛋⽩磷酸酶抑制剂混合物（100×）均购⾃***公司） 2.弃掉旧的培养基，PBS洗三遍。
3.每孔加⼊200ul刚配好的裂解液，⽴即置于冰上，在摇床上裂解30min。
4. 30min后在冰上将6孔板中的细胞收集⾄EP管中（尽可能多地刮掉细胞）。
5. 14000g，15min（4℃）离⼼，取上清于EP管中即为提取的蛋⽩（最好⽤进⼝Axygen EP管，后⽂解释原因）。
注：2~4步也可先⽤胰酶收集细胞，离⼼，PBS洗三次，再向EP管中加⼊裂解液，置于冰上摇床裂解30min。我也尝试过这种⽅法，相⽐⽽⾔，上⼀种⽅法简便并节约时间，但可能会损失⼀些细胞，可根据实际情况选择。
⼆、组织蛋⽩的提取
（全程在冰上操作）
1.将动物组织（脑、肺等）取出后分装成三份或更多（⼀份WB，⼀份qPCR，⼀份备⽤），取出后⽴即存于-80℃。（注：取完⼀块组织后⽴即冻存于-80℃，反复冻存样品对待测蛋⽩有影响，最好⽤新鲜样品实验） 3g无线摄像机2.配制细胞裂解液（现配现⽤），组织:RIPA=1mg:10ul，可根据实际情况调整。RIPA：蛋⽩酶抑制剂：磷酸酶抑制剂=99:1:1。配好后置于冰上。
3.将其中⼀份组织剪下约90mg于有钢珠的震荡匀浆器中匀浆。此匀浆器的盖⼦或芯通常置于-20℃，使⽤时取出，操作应快捷，匀浆1min基本可保持温度。
4.将匀浆加⼊90ul现配的裂解液中，冰上摇床裂解30min。
5. 14000g，15min（4℃）离⼼，取上清于Axygen EP管中即为提取的蛋⽩。
贰：蛋⽩浓度测定
我采⽤的是***公司的BCA蛋⽩定量试剂盒测定提取蛋⽩浓度，和说明书protocol差别不⼤，稍有不同，如下：
1.稀释BSA标准品以制作标准曲线：取7⽀EP管，每管加30ul⽣理盐⽔，第⼀管加30ulBSA，混匀后再取30ul⾄第⼆管，依次倍⽐稀释，最后⼀管不加为空⽩（即本底值）。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、 0.03125ug/ul、0。
2. 5倍稀释样品蛋⽩：取六⽀EP管（6个样品），各管加40ul NS，再分别取10ul样品在各管中稀释。
3.将8个标准品和稀释待测样品各加25ul于96孔板中。
4.配制BCA⼯作液：每个样品做2个重复，再加上8个标准品，⼀共20个孔，按22个孔算，以防加样损失。则需A液：
200ul×22=4400ul，B液：4400ul/50=88ul，计算好所需体积后在⼀⼲净试管中将A、B⼯作液混匀。
6.混匀后⽴即向各孔中加⼊200ul配制的BCA⼯作液，37℃孵育30min。
7.酶标仪562nm下测定各样品和BSA标准品的吸光度值，作出标准曲线，计算出待测样品的浓度。
8.根据各样品浓度计算1×loading buffer体积，将各样品浓度调为⼀致；并计算5×loading buffer的体积，加⼊各管中。混匀后沸⽔煮
15min，冰上分装，存于-20℃。
Tips
1.前⾯提到收集蛋⽩于进⼝Axygen EP管中，是为了防⽌煮沸蛋⽩时EP管盖⼦弹开，液体溅出⽽改变蛋⽩浓度。
2.关于分装体积，我提取的细胞蛋⽩调整浓度后约为1.5ug/ul，每次电泳上样20ul，所以分装体积每管50ul，⼀次或两次电泳即可⽤完，避免 反复冻融。
叁：Western Blot
⼀、WB所需试剂
可提前配制：
1. 10×电泳缓冲液：
配制250ml 10×电泳液作为母液，依次称取Tris 7.5g，⽢氨酸36g，SDS 2.5g，加双蒸⽔⾄250ml，常温保存。使⽤时⽤蒸馏⽔稀释⾄1×。
2. 1×电转液：
u交配制500ml 1×电泳液，依次称取Tris 2.9g，⽢氨酸1.45g，SDS 0.185g，加双蒸⽔400ml，待都溶解后再加⼊100ml甲醇，常温保存。
配制的电泳液和电转液可供多次Western使⽤。
注意：1.最后加⼊甲醇，若先加甲醇，Tris、⽢氨酸和SDS不易溶解。
2.溶解较慢时可⽤磁⼒搅拌器加快溶解。
磁悬浮支架图片
现配现⽤：
分离胶、浓缩胶、5% BSA溶液(w/v)、5%⽜奶(w/v)、1×TBST洗液、⼀抗和⼆抗，在WB步骤中详细介绍。
⼆、WB pr o to c o l
戴好⼝罩和⼿套，选⽤1.0mm玻板，⽤试管刷和洗洁精仔细刷洗玻板，清⽔冲洗⼲净。卡槽对齐卡好后置于软橡胶垫⽚上，夹紧，向板中加满蒸馏⽔试板⼦是否漏液。观察⼏分钟后若不漏液，将板⼦中⽔倒出，倒扣晾⼲。
（⼆）配胶：
1.配制8ml 10%分离胶，依次向⼩烧杯中加⼊蒸馏⽔3.04ml，30%丙烯酰胺
2.7ml，1.5M·pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP
80ul，TEMED 3.2ul。加⼊TEMED混匀后⽴即灌胶，⽤1ml头沿着玻板上沿从左⾄右轻轻将胶打⼊，
以免胶浓度不均匀，避免⽓泡产⽣。加完后换200ml头从左⾄右更加⼩⼼加⼊蒸馏⽔⽔封，以免冲散刚灌的分离胶。静置，当⽔和胶之间出现⼀条⽔平的折线时，即已凝固。
2.待分离胶凝固后，将⽔封的蒸馏⽔倒出，可将滤纸条放于玻板⾓吸⽔加快残留⽔流出，倒置。配制4ml 5%分离胶，依次向⼩烧杯中加⼊蒸馏⽔2.7ml，30%丙烯酰胺670ml，0.5M·pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加⼊TEMED混匀后⽴即灌胶，同上⽤
1ml头从左⾄右轻轻加⼊浓缩胶，加满后冲洗10孔梳⼦，⽔平轻轻插⼊浓缩胶中静置待其凝固。可将剩余的浓缩胶沿着梳⼦加⼊玻板中以完全密封。
3.此时，可将之前分装好的煮过的加⼊loading buffer的蛋⽩样品、预染的蛋⽩maker 和⼀⼩⽀loading buffer 置于4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均为神经毒性、致癌物质，使⽤时需⼩⼼。
2.灌胶时视线与胶⾯⽔平，注意操作，避免胶溅⼊眼睛中。
3.常温下半⼩时胶可凝固，若天⽓寒冷或需加快凝固，可将其置于37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第⼆天早上⽴即跑胶，这样就不耽误午饭时间，可头天晚上先把胶配好，凝固后取下玻板，连夹⼦、梳⼦⼀同放⼊蒸馏⽔中，4℃过夜保存。
（三）电泳：
1.将玻板卡紧电泳槽中，先在内槽加满已配好的1×电转液，⼗⼏分钟后观察是否漏液，若漏液重新调整玻板，再次卡紧，直⾄不漏液为⽌。否则，可能胶还没跑完，电转液就漏完了。
2.轻轻拔去梳⼦，第⼀孔加⼊5ul预染的蛋⽩maker ，2~7孔依次加⼊20ul待测蛋⽩样品，第8孔加⼊10ul提前融化的loading buffer。上样时轻轻加⼊，注意不要将样品加⼊其他孔，或加样过快导致样品溢出。
3.插好正负极，注意检查正负极不能插反。调节电压⾄80V（浓缩胶），跑0.5h后；将电压调⾄100V（分离胶），约1.5h后，maker分离明显，在胶底部出现⼀条蓝⾊的buffer条带，此时电泳完毕。使⽤完在实验仪器使⽤本上做好登记。
注意：避免蓝⾊条带跑出分离胶，这样有可能⽬的蛋⽩也已经跑出，所以在分离胶底部出现⼀条整齐⽔平的蓝⾊条带时，即停⽌电泳。
Little Trick
1.电泳时插好正负极后，从电泳槽底会有⼩⽓泡上升，⽓泡的数⽬和上升速率与电压⼤⼩呈正⽐。若⼩⽓泡和往常不太⼀样，观察⼏分钟后还是如此，则需检查是否加错了电泳液，或者电泳液配制有误。
2.⼀般浓缩胶80V 0.5h，分离胶100~120V 1~1.5h，具体跑胶电压和时间与⽬的蛋⽩⼤⼩、实验仪器和实验室环境都有关，需多次探索最佳条件。若⽬的蛋⽩较⼩，则尽量缩短跑胶时间，并及时观察maker位置，避免⽬的蛋⽩跑出。我分别实验了浓缩胶80V 0.5h，80V 1h，分离胶120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，结果显⽰在本实验室实验仪器下，我的⽬的蛋⽩及内参在浓缩胶
80V 0.5h，分离胶100V 1.5h条件下，分离效果最好。在此条件下，我做了⼏次重复实验，结果均⼀致。因此，总结出本实验室此⽬的蛋⽩的最佳电泳条件。
3.电泳的好坏直接影响到⽬的蛋⽩的显影情况，尤其时磷酸化⽬的蛋⽩的⼆聚体，若电泳条件优化，结果可清晰显出蛋⽩表达情况。所以探索最佳电泳条件是决定胜负关键⼀步。
4.电泳快结束时即可准备转膜所需的滤纸和PVDF膜，浸泡在电转液中。建议在第⼀次WB后分别剪好不同⼤⼩的硬纸⽚，标好⾯积和孔数（即样品数），存好以后随时使⽤。
5.WB中夹取PVDF膜最好使⽤平头镊⼦，并夹住膜左上⾓，可最⼤程度减⼩对膜上蛋⽩的损害。
（四）切胶：
电泳结束后，取出玻璃板，稍洗，洗净电泳槽，放好。轻轻撬开玻璃板，根据maker位置和⽬的蛋⽩分⼦量⼤⼩在玻璃板上切胶，为了防⽌切歪，可在玻璃板下垫上上述剪好的同切胶⼤⼩⼀致的硬纸⽚。⼀般⼀块胶需切下⽬的蛋⽩和内参两⼩块胶，将切下的胶分别浸泡在电转液中。
（五）转膜：
加工助剂acr
1.根据每⼀块切胶的⼤⼩剪6张同样⼤⼩的滤纸和⼀张PVDF膜，浸泡于电转液中，可以提前准备好的硬纸⽚为模板剪。PVDF膜先经甲醇活化20s 后浸泡于电转液中。
2.在电转仪上制作“三明治”结构转移膜，最下⾯放三层滤纸，然后依次放PVDF膜，胶，三层滤纸，⽤玻璃棒轻轻赶⾛⽓泡（注意上下三层滤纸之间不能接触，否则易造成短路）。盖上盖⼦，根据膜的总⾯积调整电流，电转2h。
3.在电转的同时，可以配制以下液体，事先根据膜的数量计算好所需体积：
以⼀块膜为例，封闭5ml+稀释⼀抗4ml+稀释⼆抗4ml，需要13ml，则配制15ml。
5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，称取0.75g BSA晶体，溶于15mlTBST中，漩涡振荡器混匀，现⽤现配，4℃保存（若⽬的蛋⽩为磷酸化蛋⽩时配制）。
5%⽜奶(w/v)：配制15ml 5%⽜奶(w/v)，称取0.75g脱脂奶粉，溶于15ml TBST中，漩涡振荡器混匀，现⽤现配，4℃保存。
1×TBST洗液：使⽤时将100×TBST⽤双蒸⽔稀释⾄1×，常温保存。
Little Trick
1.关于电转膜，有些使⽤NC膜。我没有尝试过NC膜，但隔壁实验室使⽤NC膜多次WB结果仍不理想，换⽤PVDF膜后有所改善。因此建议还是使⽤PVDF膜，可购买Millipore的PVDF膜，⼀卷有些贵，但是可以够⼀个实验室⽤好⼏年哪。最好不要在经销商购买分装的的PVDF膜，另⼀实验室⼀同学想着价格便宜也就只做⼏次，就从试剂公司只买了100cm2的膜，结果这价格虚⾼不说，⽽且膜还是假的，直到做完实验了才发现，蛋⽩样品也浪费了。所以建议还是购买Millipore公司原装的PVDF膜。
2.关于电转⽅式，有些采⽤湿转，有些采⽤半⼲转，两种⽅式均可。个⼈觉得半⼲转⽅便简捷些。
（六）封闭：
1.电转结束后，根据maker位置和⽬的蛋⽩及内参⼤⼩剪膜。可在标有maker的⼀边左上⾓剪⼀个⼩⾓，以清楚哪⼀条带是1号样品。
2.分别⽤已配好的5% BSA和5%⽜奶封闭⽬的蛋⽩和内参，室温摇床上孵育2h。根据盒⼦⼤⼩，加⼊封闭液的量需没过膜。
（七）孵育⼀抗：
1.配制p-STAT1⼀抗（公司），1:500稀释，加⼊上述配制的5% BSA 4ml，再加⼊8ul p-STAT1⼀抗，混匀，现配现⽤。
配制actin⼀抗（公司），1:2000稀释，加⼊上述配制的5%⽜奶4ml，再加⼊2ul actin⼀抗，混匀，现配现⽤。
2.将PVDF膜从封闭液中取出，可⽤平头镊⼦⼩⼼放⼊塑料⼿套的⼿指中，加⼊⼀抗，封⼝，使膜完全浸泡在⼀抗中，放⼊冰箱，4℃过夜。我⼀
般⽤封⼝膜做成⼩盒，置于⼤玻璃平⽫中，放⼊PVDF膜，⽤从上到下向膜上加⼀抗，完全浸没，之后和PCR上样仪⼀同固定在摇床上，4℃孵育过夜。
（⼋）回收⼀抗：硅料回收
次⽇，回收⼀抗，做好标记，-20℃保存，可再使⽤3~4次。将膜放⼊1×TBST中，摇床上清洗三次，每次10min。
（九）孵育⼆抗：
1.配制具有种属特异性的HRP标记的⼆抗（抗⿏或抗兔），1:2000稀释，加⼊上述配制的5%⽜奶4ml，再加⼊2ul ⼆抗，混匀，现配现⽤。
2.TBST洗完膜后，加⼊⼆抗，室温摇床上孵育2h。
（⼗）显影：
1.⼆抗孵育完后，回收，-20℃保存。1×TBST摇床上洗膜三次，每次10min。
2.⼀条⽬的蛋⽩即⼀张膜需要100ul发光液A和100ul发光液B，根据膜数计算⽤量，提前4℃混合好发光液A和B。
3.到暗室中加混合好的发光液，在胶⽚左上⾓剪⼀⼩⾓（和PVDF膜⼀致），曝光胶⽚，可分别不同时长曝光，如15s，30s，1min，5min等，然后在显影液和定影液中显影，放⼊⾃来⽔中。出暗室后，将胶⽚挂起晾⼲。
也可⽤Bio-rad凝胶成像系统照相，选择不同的曝光时间成像。
Little Trick1.需通过不同曝光时间探索某蛋⽩最佳曝光时间，多次重复实验即可采⽤此曝光时长。我最开始也是在暗室中显影，后来⽤Bio-rad凝胶成像系统照相，对⽐结果发现后者的结果更加清晰明显，背景也更加⼲净，之后就⼀直⽤成像仪曝光照相了。
2.夹取胶⽚可⽤普通镊⼦，但也只夹胶⽚左上⾓，避免损害胶⽚上曝光的蛋⽩条带。
3.胶⽚左上⾓maker⼀侧⼀定要剪⼀⼩⾓或做其它标记，才可在显影后明显对应各个样品。
4.若暗室曝光，可能内参蛋⽩发光液刚加上就出现很亮的条带，这时最长曝光15s已经⾜够。
（⼗）膜重⽣：
若显影效果不好，可将膜重⽣，再次显影，省去了配胶、电泳和电转等步骤。
1.加4ml蛋⽩印迹膜再⽣液，室温摇床30min。
2. 1×TBST洗3次，每次10min。
3.5% BSA或5%⽜奶封闭2h。
4.⼀抗4℃孵育过夜。
5.次⽇1×TBST洗三次，每次10min。
6.⼆抗孵育2h。
7.1×TBST洗三次，每次10min，曝光成像。
（本实验室使⽤的100×TBST、⼆抗和⽩印迹膜再⽣液均购⾃***公司）
但是我实验⼏次膜重⽣后的结果并不理想，所以还是乖乖从头开始做WB。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议