CC基序趋化因子受体1作为生物标记物和靶点筛选药物中的用途

cc基序趋化因子受体1作为生物标记物和靶点筛选药物中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及cc基序趋化因子受体1，特别是cc基序趋化因子受体 1作为生物标记物和靶点筛选药物中的用途。

背景技术：

2.乳腺癌是发生于乳腺组织腺上皮的恶性肿瘤，严重威胁女性健康。根据globocan2020 公布的数据，乳腺癌已经超过肺癌成为全球发病率第一的癌症，几乎占所有癌症病例的四分之一。尽管中国的乳腺癌发病率远低于美国和欧洲国家，但过去几十年中国是乳腺癌发病率增长速度最快的国家之一，2020年乳腺癌的发病率是中国女性所有癌症中最高的，达到 37.7/10万。发病率的激增使乳腺癌成为严重危害人类健康的重大公共卫生问题。
3.尽管随着早期筛查预防意识的提高和科学技术的进步，原发性乳腺癌患者的生存率显著提高。但仍有近12％被诊断为乳腺癌的患者最终会发生包括骨骼、肺、大脑和肝脏在内的远处器官转移，并且转移性乳腺癌患者的预后普遍不佳，平均5年生存率约为25％。临床实践中常使用的乳腺癌方法，如手术、化学疗法和放射疗法等，虽然可以有效控制原发性肿瘤的生长，但在预防复发和转移方面效果不佳。积极寻阻断肿瘤细胞转移和定植的药物和方法，是提高乳腺癌患者效果和长期生存率的有效手段。因此，本领域迫切需要为乳腺癌或乳腺癌转移的诊断和提供新的标志物和手段。
4.与许多其他转移性癌症类型一样，乳腺肿瘤细胞和肿瘤微环境中发生的特定免疫、炎症等分子变化有助于乳腺肿瘤细胞从原发性肿瘤块脱离、侵入肿瘤基质、渗入附近血管或淋巴管、在远端器官中促进乳腺肿瘤细胞存活。趋化因子(chemokines)是一种可趋化细胞定向移动的低分子量分泌蛋白，主要分为cxc(α类趋化因子)、cc(β类趋化因子)、cx3c和c四个亚类。
5.当机体受到刺激时会产生大量不同的趋化因子。趋化因子需要与趋化因子受体 (chemokines receptor)结合才能发挥生物学效应。cc基序趋化因子受体1(c-c motif chemokinereceptor 1,ccr1)编码β趋化因子受体家族成员，该家族属于七跨膜g蛋白偶联受体，可以通过g蛋白依赖性和g蛋白非依赖性途径诱导细胞内信号传导，在多种细胞类型中广泛表达，并参与免疫细胞的激活和运输。在g蛋白依赖性信号传导中，随着趋化因子与受体结合，gα亚基发生gdp/gtp交换，导致异源三聚体gαβγ解离为活性gtp结合的gα和 gβγ二聚体。每种都能够激活下游信号通路，例如激活rac、rho和cdc42，以及抑制腺苷酸环化酶。另一方面趋化因子与受体结合后也可能募集β-arrestin，从而激活g蛋白非依赖性途径，如akt、p38、ampk和erk 1/2。ccr1是一种可以磷酸化erk 1/2的受体，该蛋白激酶有助于激活ras-raf-mek-erk mapk信号通路，而该通路在细胞凋亡和增殖中起重要作用。特别是mapk级联反应被认为是人类癌症最重要的致癌驱动因素。
6.ccr1除了在免疫细胞中发挥重要作用，还在很多易发生转移的癌细胞中被检测到
高表达，包括前列腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤和造血淋巴肿瘤等。在骨髓瘤骨病小鼠模型中， ccr1阻断可减少体内肿瘤负荷和骨溶解；ccr1的高表达促进多发性骨髓瘤浆细胞在体内的传播,ccl3/ccr1信号传导可能使多发性骨髓瘤浆细胞从骨髓(bm)排出；阻断 ccl3-ccr1/ccr5和cxcl12-cxcr4轴可抑制白血病造血微环境中的treg积累并延缓白血病进展。ccr1的异常高表达与多种肿瘤的恶性程度及预后的相关性表明ccr1可以作为癌症诊断、预后和的靶点进行进一步研究。目前还未见ccr1促进乳腺癌转移及靶向 ccr1乳腺癌转移的相关研究和报道。

技术实现要素：

7.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了cc基序趋化因子受体1作为生物标记物和靶点筛选药物中的用途，所述的这种cc基序趋化因子受体1作为生物标记物和靶点筛选药物中的用途要解决现有技术中的试剂和药物对于乳腺癌的检测和效果不佳的技术问题。
8.本发明提供了cc基序趋化因子受体1在制备检测乳腺癌肺转移或者乳腺癌预后不良的生物标记物中的用途。
9.本发明提供了检测cc基序趋化因子受体1的试剂在制备检测乳腺癌肺转移或者乳腺癌预后不良的试剂盒中的应用。
10.本发明提供了cc基序趋化因子受体1作为靶点在筛选抑制乳腺癌或者乳腺癌肺转移的药物中的应用。
11.本发明提供了cc基序趋化因子受体1拮抗剂在制备抑制乳腺癌或者乳腺癌肺转移的药物中的应用。
12.进一步的，所述的cc基序趋化因子受体1拮抗剂为cc基序趋化因子受体1抑制剂 bx471。bx471(zk-811752)是以一种口服有效的、选择性、非多肽的ccr1拮抗剂，ki值为1nm，对其选择性是对ccr2，ccr5和cxcr4的250倍。
13.本发明发现与乳腺癌原位灶和不易转移的乳腺癌细胞系相比，ccr1在乳腺癌转移灶和易转移的乳腺癌细胞系中异常高表达。体内动物实验证实其可促进原位瘤的转移，而使用ccr1拮抗剂后可以抑制该转移的发生。体外细胞实验证实高表达ccr1的肿瘤细胞能够被分泌ccl3的中细粒细胞吸引从而发生细胞的侵袭迁移。
14.本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明研究发现，cc基序趋化因子受体1(c-c motif chemokine receptor 1,ccr1)在乳腺癌肺转移灶和肺转移细胞系中高表达，并且高表达ccr1的乳腺癌患者的总生存期和无进展生存期明显短于ccr1低表达的乳腺癌患者。使用ccr1抑制剂bx471处理人乳腺癌mda-mb-231细胞系能有效抑制肺中性粒细胞对mda-mb-231细胞的趋化作用；使用ccr1抑制剂bx471分别处理小鼠乳腺癌4t1细胞系，然后将细胞通过尾静脉注射入balb/c小鼠体内，结果发现bx471能有效抑制4t1细胞的肺转移。可见，体外细胞趋化实验及体内动物实验，都证明ccr1是导致乳腺癌肺转移和预后不良的关键靶点，ccr1的抑制剂可以被开发为抑制乳腺癌肺转移的药物。
附图说明
15.图1显示了ccr1(gene id:1230)在乳腺癌组织中高表达。
16.图2显示了在淋巴转移(lymph node positive)的乳腺癌患者中，ccr1表达水平高的患者总生存期更短。
17.图3显示了ccr1在mmtv-pymt乳腺自发瘤小鼠的乳腺原位和肺转移中高表达，且转移灶的表达水平更高。
18.图4显示了ccr1表达在易转移的三阴性乳腺癌组织显著高于不转移的管腔型乳腺癌组织。
19.图5显示了采用mojosort
tm
mouse ly-6g selection kit从小鼠的肺组织单细胞悬液中分离得到了大量高纯度的中性粒。
20.图6显示了肺中性粒细胞能够在体外趋化mda-mb-231细胞定向侵袭，ccr1抑制剂 bx471能够抑制这一过程。
21.图7显示了过表达ccr1可以促进4t1细胞肺转移，20μm bx471(ccr1抑制剂)预处理鼠乳腺腺癌细胞系4t1(gfp)48小时，可以抑制4t1细胞肺转移。
具体实施方式
22.材料和方法：
23.1.细胞
24.乳腺癌细胞系4t1和mda-mb-231来自美国模式培养物保存中心(atcc， american type culture collection)，并保存在我们的实验室中。(同时均为市售产品)
25.2.小鼠
26.mmtv-pymt小鼠由fvbn和pymt小鼠繁育而来。6周龄雌性balb/c小鼠从斯莱克动物公司(中国上海)采购。动物实验的所有程序均经同济大学医学院动物管理和使用委员会批准。
27.3.抗体
28.ccr1货号nb100-56334，美国novus biologicals；
29.gapdh货号5174，美国cst；
30.cd45-apc-cy7货号103116，美国biolegend；
31.apc-cd11b货号101211，美国biolegend；
32.pe-ly6g货号127607，美国biolegend；
33.mojosort
tm
mouse ly-6g selection kit货号480124美国biolegend。
34.4.试剂
35.bx471(synonyms:zk-811752)货号hy-12080美国mce；
36.dimethyl sulfoxide(synonyms:dmso)货号hy-y0320美国mce；
37.实施例1乳腺癌肺转移模型
38.1)乳腺癌自发瘤模型，选用5周龄自发乳腺癌mmtv-pymt雌鼠在spf环境中正常饲养到第14周。14周时处死小鼠获得其原位肿瘤和肺转移灶，取约1/4cm3的原位肿瘤组织和小鼠的左肺叶至于4％的多聚甲醛中固定，并进行石蜡包埋制成0.6μm的石蜡切片。将约1/8cm3的原位肿瘤组织和从同一只小鼠肺部机械分离下来的乳腺癌转移灶分别剪碎并置于2ml的 trizol(10296010，美国invitrogen)中用于总rna的提取。
39.2)乳腺癌肺转移模型，选用5周龄的balb/c雌鼠15只，在spf环境中正常饲养一周。
然后将小鼠随机分成对照组(ctrl)、ccr1基因过表达组(ccr1)组和bx471预处理组，每组各5只小鼠。然后通过尾静脉分别向ctrl组注射1
×
106个使用1/10000dmso预处理 48h的4t1细胞(gfp标记)，向ccr1组注射1
×
106个使用1/10000dmso预处理48h的过表达ccr1的4t1细胞(gfp标记)，向bx471组注射1
×
106个使用20μm bx471(hy-12080， mce)预处理48h的4t1细胞(gfp标记)。
40.实施例2细胞培养
41.1)4t1细胞用含有体积百分比为10％胎牛血清和体积百分比为1％青霉素-链霉素的 roswell park memorial institute-1640(rpmi-1640)培养基在37℃、体积百分比为5％co2培养箱中培养；
42.2)mda-mb-231用含有体积百分比为10％胎牛血清和体积百分比为1％青霉素-链霉素的dmem培养基在37℃、体积百分比为5％co2培养箱中培养。
43.实施例3ccr1的差异表达分析
44.为了明确ccr1在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达差异，我们分析了tcga数据库 (https://portal.gdc.cancer.gov/projects/tcga-brca)中762位女性乳腺癌患者的癌组织和104 位女性的正常乳腺组织中ccr1基因的表达水平(图1)。采用r4.1.3统计绘图，使用了“limma3.50.3”、“ggplot2 3.3.6”和“ggpubr 0.4.0”等r包。采用wilcox.test进行统计检验，“***”、“**
”ꢀ
和“*”代表p值小于0.001、0.01和0.05。
45.由图1显示，ccr1在乳腺癌组织中的表达水平明显高于正常乳腺组织。
46.实施例4ccr1的表达水平与乳腺癌患者的相关性分析
47.为了评估ccr1的表达水平与乳腺癌患者生存及预后的关系，我们使用在线网站 kaplan-meier plotter(http://kmplot/analysis/index.php？p＝service&cancer＝breast)绘制生存曲线。首先基于ccr1基因的表达水平，将1656名淋巴结阳性的乳腺癌患者(lymph nodepositive)分成ccr1高表达组和ccr1低表达组，然后根据患者的生存状态绘制rfs生存曲线(图2)。采用log-rank test进行统计检验。
48.由图2显示，在淋巴结转移呈阳性的乳腺癌患者中，高表达ccr1的乳腺癌癌患者无复发生存期更短，预后更差。
49.实施例5免疫组化
50.为了探究乳腺癌组织原位和肺转移灶的ccr1表达差异，我们对来自同一只乳腺癌自发肿瘤小鼠(mmtv-pymt小鼠)的乳腺原位组织、乳腺癌肺转移灶的石蜡切片进行免疫组化染(图3)。为了探究ccr1在不同类型的乳腺癌中的表达差异，我们分别对3例luminal 型人乳腺癌组织、和3例三阴性乳腺癌组织进行免疫组化染(图4)。
51.1)将石蜡切片逐步浸泡于二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、90％乙醇、85％乙醇、75％乙醇和水中，使其完全脱蜡至水；
52.2)采用edta(ph＝9)抗原修复液通过微波加热法对抗原进行修复；
53.3)滴加内源性过氧化物酶封闭液使其完全覆盖样品，室温孵育10min；
54.4)使用含10％山羊血清的封闭液室温封闭一小时
55.5)4℃下孵育ccr1(1：200)一抗(nb100-56334，美国novus biologicals)过夜
56.6)使用pbs清洗切片去除多余的一抗，然后在室温下与hrp缀合的山羊抗兔igg二抗 (ab6721,美国abcam)孵育1小时。
57.7)使用dab显试剂(p0203，中国beyotime)室温显2分钟；
58.8)使用苏木素(c0107，中国beyotime)复染细胞核1分钟；
59.9)pbs清洗去除多余的染料，然后将石蜡切片逐步浸泡于75％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、 95％乙醇、100％乙醇和二甲苯中，使其完全脱水，并用中性树胶进行封片。
60.10)最后使用leica dm300显微镜采集20x的图像。
61.通过实验可知，在mmtv-pymt小鼠中，同一只小鼠的肺转移灶中ccr1的表达水平比肿瘤原位ccr1的表达水平要高(图3)；在乳腺癌患者的肿瘤组织中，易发生转移的三阴性乳腺癌组织中ccr1的表达水平相较于不易发生转移的luminal型乳腺癌组织要高(图4)。
62.实施例6肺中性粒细胞的分离和鉴定。
63.为了探究肺中性粒细胞对乳腺癌细胞的趋化作用，我们首先从10周龄的mmtv-pymt 雌性小鼠的肺组织中分离中性粒细胞。
64.1)使用预冷pbs从小鼠的右心室进行灌注，直到肺中的循环白细胞完全耗尽；
65.2)然后取下肺组织并切碎；
66.3)用酶混合物(150u/ml胶原酶ⅳ、20u/ml分散酶、5u/ml弹性蛋白酶和0.33u/ml dnasei)在37℃消化组织30分钟；
67.4)使用70μm过滤器过滤去除未完全消化的组织，收集单细胞悬液；
68.5)使用mojosort
tm
小鼠ly-6g选择试剂盒(480124，美国biolegend)从肺单细胞悬液中分离中性粒细胞；
69.6)取出10000个分离出的中性粒细胞，然后使用流式抗体apc-cd11b和pe-ly6g来检测中性粒细胞的阳性率。到中性粒细胞阳性率大于95％时，用于后续实验。
70.由图5可知：该方法可以成功从小鼠的肺组织悬液中分离大量的中性粒细胞且阳性率高于98％，可以用于肿瘤细胞的趋化实验。
71.实施例7中性粒细胞趋化效应测定
72.为了探究肺中性粒细胞对乳腺癌细胞的趋化作用，我们进行了体外趋化实验(图7)。
73.1)将ecm gel(e1270,sigma-aldrich,usa)按体积比1：6与dmem培养基混匀后预先铺在8μm孔的transwell小室(美国康宁)中，每个小室80ul；
74.2)将2
×
104个预先饥饿培养6小时的mda-mb-231细胞添加到小室的上面；
75.3)将5
×
105个新鲜分离的肺中性粒细胞被添加到下室的下面作为趋化因子的来源；
76.4)向bx471组的上室中加入20μm bx471(使用dmso溶解，再按1\10000稀释到工作浓) 以阻断肿瘤细胞的ccr1；向其他组加入1\10000(体积比)dmso作为对照；
77.5)在37℃含5％co2的培养箱中孵育12小时；
78.6)取出小室，并用4％的多聚甲醛固定10min；
79.7)将小室至于0.4％结晶紫染料中染30min，然后使用棉球擦去小室内部的细胞；
80.8)晾干小室，并使用光学显微镜采集小室底部细胞的照片(10x)；每个小室随机采集5张不重合的照片，然后使用image j进行计数，统计每个视野中的平均细胞量，用来代
表该小室细胞的迁移能力。实验重复3次，采用t-test进行统计检验，“**”代表p值小于0.01。通过实验可知，肺中性粒细胞可以在体外趋化乳腺癌mda-mb-231细胞定向迁移，ccr1 抑制剂bx471可以抑制乳腺癌mda-mb-231细胞向中性粒细胞迁移(图6)。
81.实施例8流式细胞术
82.为了评估乳腺癌肺转移模型中癌细胞的肺转移情况，我们先按照前述的方法将小鼠的肺消化成到细胞悬液，然后通过流式细胞术检测肿瘤细胞的占比(图7)。
83.1)根据制造商的说明，使用rbc裂解缓冲液(420301，美国biolegend)裂解单细胞悬液样品中的红细胞；
84.2)然后4℃避光孵育荧光偶联抗体cd45-apc-cy7(103116，美国biolegend)20分钟；
85.3)然后使用pbs清洗去除多余的抗体后重悬细胞，并通过流式细胞仪检测fitc通道和 apc-cy7通道；
86.4)apc-cy7通道用来排除cd45+的免疫细胞(肺部免疫细胞数量波动较大，会对肿瘤细胞的占比造成影响，所以有必要去除)，
87.5)fitc通道用来统计gfp+的肿瘤细胞的数量；
88.6)统计gfp+的肿瘤细胞占肺组织中非免疫细胞的比例，使用该比例评估肿瘤细胞的肺转移情况；实验共计3个分组，每组5只小鼠，采用t-test比较ctrl-ccr1以及ctrl-bx471 组之间差异的显著性，“**”和“*”代表p值小于0.01和0.05。
89.通过实验可知，过表达ccr1的4t1细胞更容易向小鼠的肺部转移，ccr1抑制剂在体外预处理4t1细胞48小时可以抑制4t1细胞向小鼠肺部转移(图7)。

技术特征：

1.cc基序趋化因子受体1在制备检测乳腺癌肺转移或者乳腺癌预后不良的生物标记物中的用途。2.检测cc基序趋化因子受体1的试剂在制备检测乳腺癌肺转移或者乳腺癌预后不良的试剂盒中的应用。3.cc基序趋化因子受体1作为靶点在筛选抑制乳腺癌或者乳腺癌肺转移的药物中的应用。4.cc基序趋化因子受体1拮抗剂在制备抑制乳腺癌或者乳腺癌肺转移的药物中的应用。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的cc基序趋化因子受体1拮抗剂为cc基序趋化因子受体1抑制剂bx471。

技术总结

本发明提供了CC基序趋化因子受体1在制备检测乳腺癌肺转移或者乳腺癌预后不良的生物标记物中的用途。本发明还提供了检测CC基序趋化因子受体1的试剂在制备检测乳腺癌肺转移或者乳腺癌预后不良的试剂盒中的应用。本发明提供了CC基序趋化因子受体1作为靶点在筛选抑制乳腺癌或者乳腺癌肺转移的药物中的应用。本发明提供了CC基序趋化因子受体1拮抗剂在制备抑制乳腺癌或者乳腺癌肺转移的药物中的应用。本发明发现与乳腺癌原位灶和不易转移的乳腺癌细胞系相比，CCR1在乳腺癌转移灶和易转移的乳腺癌细胞系中异常高表达。体内动物实验证实其可促进原位瘤的转移，而使用CCR1拮抗剂后可以抑制该转移的发生。抑制该转移的发生。抑制该转移的发生。