课程名称：生化实验B 实验日期：
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一、背景及目的
血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红，无氧时为暗红。
凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。 光耦电路
凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。
影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度
2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH 6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
动物胶配方整个过程影响凝胶过滤的因素主要有：
1、层析柱的选择 ：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。
2、 加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。
3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。
目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：
1、脱盐 2、用于分离提纯 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 5、蛋白质的复性
二、 实验原理
层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。按操作形式可以划分为：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。按层析的机理可以划分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
凝胶过滤是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱，大分子不能进入凝胶颗粒的静止相中，只能在凝胶颗粒
间随流动相移动，因而可以被较快洗出，而小分子则能够自由进出凝胶颗粒，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此需要花费较长时间流经柱床，从而使不同大小的分子得到分离。
本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐的高铁血红蛋白立即被还原为紫红的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红的氧合血红蛋白。铁是小分子量化合物，呈黄带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼就可以检验分离效果。
三、仪器与试剂、实验材料
1、仪器
层析柱 恒流泵（HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂） 胶头滴管
50ml烧杯 3个 玻璃棒
激光打孔2、试剂
磷酸缓冲液（老师已配好）
还原层试剂 （1:1的40nM FeSO4和80 mMNa2H2EDTA,0.2MNaHPO4, ,老师提供）
Sephadex G-25
3、实验材料
血红蛋白样品（1ml抗凝血加10ml pH7的20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁，浓度达5mg/ml，老师提供）
四、实验步骤
1、 凝胶溶胀：老师已准备好
2 、 检验： 旋上层析柱下端柱帽，加少量去离子水，看水是否顺利流出，如果流速过缓，
用洗耳球自上端吹气，使其畅通。上下端倒置，按上述步骤检验。
3、 装柱及平衡：取下上端柱帽，装入5cm左右的洗脱液，溶胀好的凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开始洗脱，使柱中的凝胶一直处在溶液中，装柱长15cm左右。溶液液面应该高于凝胶面3-5cm，防止凝胶因脱水而毁柱。实验中沉降完成后，液面高于凝胶面4cm左右。此时观察柱面，上下均一，无界面，裂隙。旋上上端柱帽，细管管接上磷酸盐缓冲液，下端柱帽的细管接恒流泵，开始平衡洗脱。过程中调节好流速，6滴/分。平衡过程20分钟。
4、 上样：事先剪好略小于层析柱内径的滤纸片，打开上柱帽，将滤纸片放入层析柱中，使其自然飘落覆盖在凝胶面上，防止上样时液滴对床面的冲击。确定流速后准备上样。利用恒流泵排气键加速洗脱，直至洗脱液面与胶床液面相切，停止洗脱。用滴管加0.7ml还原试剂，小心注入胶床液面中央。开始洗脱，待液面与凝胶床面相齐时，关泵。上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。上0.7ml血红蛋白样，开泵，至液面与胶面相齐，关泵。上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。上5ml的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁。
5、 待黄液体全部流出，开排气键，加速洗脱10分钟
五、结果
1、实验现象
还原层上样时，溶液呈黄，当还原液面与凝胶床面相切时，床面以下两厘米左右呈现黄。
加上褐的血红蛋白样品时，开启泵。此时褐下渗，在未加入缓冲液之前，褐带下端已经开始变为暗红。层析柱上的带由上至下依次为黄，褐，暗红。
当上5ml缓冲液并开始洗脱时候，褐全部变为暗红，红带下端颜变浅。此时即为两个带，上端黄下端暗红。
开始洗脱七分钟时，暗红带下端开始变鲜红，随时间推移，暗红带全部转变为鲜红。
过程中，红带在下，黄带在上。两带一直下移。带边界不是很清晰，而且与其他组的同学相比，鲜红较浅。
随带的下移，两带间距变大。
当开始流出红液体时，用小烧杯接收，待红全部流出用了30分钟。
当开始有黄液滴流出时，用小烧杯接收，黄液体全部流出用了7分钟。
2、现象解释
血红蛋白样品中的铁离子最初为三价，显褐。当经过还原带时，三价铁被还原成二价，生成暗红的还原型血红蛋白。还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧气结合生成鲜红的氧合血红蛋白。
血红蛋白分子量很大，分子直径大，不能进入凝胶孔穴内部，只能在凝胶颗粒间移动，所以洗脱速度较快。而铁分子量小，分子直径小，能够进入凝胶颗粒孔穴内部，故洗脱速度较慢。
3、凝胶过滤效果
相比于其他组的实验现象，我们组的效果不是太好。刚开始的时候，两个带分离效果不
好，没有形成比较清晰的界限，但在最后终于是分开了，而且随着时间的推移，两带间距拉大。理论上讲，两带的间距应该保持不变，间距变大的原因，可能是胶床面上的滤纸片没有放平，而且床柱的内部有裂隙，在外部无法观察到。
最后变成的鲜红带相对颜较浅，分析原因，是因为在加血红蛋白样品时没有震动试管，而血红蛋白分子又容易沉降，导致加入的血红蛋白样品较少。
六、思考题
总结分析柱层析技术操作的关键步骤和操作要领和技巧。
1、装柱。如果装柱不均匀（没有填严实），使得柱子出现太多气泡，导致分离压铸机料筒的设计8 ~& l1 y# T. o" ?! z$ H效果不好。湿法装柱比干法装柱效果要好。
这就要求在湿装时，要边搅拌边加入填柱料（硅胶或凝胶）。而干法装柱时则要注意密实程度。填完后应该从侧面敲打，使床柱更密实。
要求柱面上下均一，无界面，裂隙。
短期负荷预测装柱后加滤纸片的时候应使其自然飘落在凝胶液面上。
2、恒流泵流速。根据实验要求的不同要选择不同的流速。像本次试验要求流速6滴/分，如果过快的话，分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。如果过慢，则耗时太长。
3、上样。上样的时候每次加样之前一定要停止洗脱。否则很可能造成液面到达胶面以下而毁柱。另外加样的时候要用滴管把液体送到接近滤纸的地方再轻轻滴加，防止液体冲击对胶面造成影响。
七、参考文献
1 、 百度百科 凝胶过滤层析 baike.baidu/view/81744.htm
摇臂2 、 百度百科 层析 baike.baidu/view/15375.htm#2
3 、 赵武玲主编，《基础生物化学》，中国农业大学出版社，2008年9月第一版
4 、 有参考胡老师课件
八、实验小结
这次实验差点就失败了，应该是装柱的时候出了点问题，而在取血红蛋白样品的时候也没有提前摇匀。
实验前应该多考虑，多思考，并在实验中注意团队合作。
老师在实验前讲了好多道理，给了我们很大的启发。我喜欢这样不单单教授理论知识的老师。
在实验之前老师提出了一个问题，血红蛋白中的亚铁离子为什么不会被氧气氧化。查了好多资料，可惜看不太懂，无法理解，还是自己的基础知识没有学充分啊。
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